LC-MS法测定Beagle犬血浆中烟酸浓度及体内药动学研究

作者:袁京群，吴筱丹，李士敏，楼健

摘要： 目的：建立测定Beagle犬血浆中烟酸的液相色谱一质谱联用法。方法：色谱柱为Agilent Zorbax SB—Cl8(150mm×2.1mm，5μ m);以甲醇和0.05% 甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱;流速0.2 mL/min;柱温25℃ ;质谱条件为电喷雾电离源(ESI)，以选择性正离子方式检测，烟酸和内标甲硝唑的选择检测离子分别为m/z 124.10([M+H] )、m/z 172.20([M+H] )。并用健康Beagle犬6只，单剂量给予烟酸片1000 mg/只，进行了血药浓度的测定。结果：烟酸血浆线性范围为0.2003～250.4 μg/mL，检测限为50.08 ng/mL，定量限为0.2003 μg/mL，方法回收率均大于95% 。结论：本方法专属性强，灵敏度高，线性关系良好，操作简便，适用于药代动力学研究。

LC -M S Studies on Determination of Nicotinic Acid in Beagle Dog Plasma and Its Pharmacokinetics

YUAN Jing—qun。WU Xiao—dan，LI Shi—min，L0U Jian

(1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University，Hangzhou 310031;

2.Center of Analysis and Measurement of Zhejiang University，Hangzhou，3 10029)

Abstract: 0bjective：To develop a sensitive and specific LC/MS method for determination of nicotinic acid in Beagle dog plasma.Methods：The LC/MS method was performed with Agilent Zorbax Eclipse SB—C 18(2.1 mm×150mm，5μm).The mobile phase consisted of CH3OH and 0.05%HCOOH，and gradient elution was adopted.Analysis were run at flow rate of0.2 mL/min.The temperature of column was 25℃.AP—ES1 was applied and 0pcrated in positive mode.The ion of monitor：m/z 124.10(nicotinic acid)，m/z 172.20(metronidazole，internal standard).Blood samples were obtained after a single dose of 1000 mg total nicotinic acid tablets.Results：The linear calibration curve was observed in the concentration range of 0.2003—250.4 g/mL。.The LOD and LOQ were 50.08 ng/mL and 0.2003 g/mL ，respectively.11he relative recoveries were more than 95% ，and the inter-and intraday-precision(RSD)was below 8.0% .Conclusion：The method was proved to be convenient，sensitive and rapid，and suitable for pharmacokinetic study of nicotinic acid in Beagle dogs.

Key words：LC/MS;nicotinic acid;plasma drug concentration;pharmacokinetics

烟酸为B族维生素之一，在体内能迅速转化为烟酰胺。然后成为辅酶I和辅酶Ⅱ的组成部分。临床上低剂量的烟酸主要应用于预防和治疗因缺乏烟酸而引起的糙皮病，给药剂量为每次50—300 mg，每日3—4次。据文献报道，大剂量时可用于降血脂，但应用剂量的报道不一致，给药剂量为每次1500 mg，每日剂量可达3—9 g。有关血浆中烟酸的测定方法主要是采用离子对高效液相色谱法 ，未见有高效液相色谱一质谱联用方法的相关报道。

本实验建立高效液相色谱一质谱联用的方法测定血浆中烟酸的药物浓度，旨在为l临床进行药动学和生物等效性研究提供测定方法。

1 仪器与试药：Agilent 1 IOOLC/MSD SL型高效液相色谱一质谱联用仪(含Agilent 1100二元输液泵，电喷雾离子化接口的四极杆质谱检测器及自动进样器等);XW一80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);离心机(SORVALL Biofuge stratos)。烟酸对照品，由浙江海正药业提供;烟酸片，每片100 mg(南京白敬宇制药厂，批号：030702)。甲醇为色谱纯(德国Merck公司)，其余试剂均为分析纯，水为市售娃哈哈纯净水。

2 色谱条件及质谱条件

色谱条件：采用Agilent Zorbax SB—Cl8(2.1mm×150 mm，5μm )色谱柱，DiamonsilC18保护柱;流动相为甲醇和0.05% 甲酸水溶液，梯度洗脱：0～15min，甲醇从4%至95% ;流速0.2 mL/min;柱温25℃ 。

质谱条件：AP—ESI正离子模式，干燥气流速l3 L/min，干燥气温度350℃ ，雾化气压力207

kPa，毛细管电压4000 V，碎片电压100 V，选择性离子检测(SIM)：烟酸m/z 124.10[M+H] ，甲硝唑m/z 172.20[M+H] 。

3 血浆样品处理方法

取血浆100μL，加内标甲硝唑溶液(1.006 mg/mL )10μL，旋涡振荡30 S，加入甲醇一0.05%甲酸水溶液(80：20)的混合溶液900μL，旋涡振荡30 S，离心(20000 r/min )30min，取上清液，微孔滤膜(0.45 μm)过滤后取5μ 进HPLC—MS分析。

4 方法专属性

在本色谱条件下，对空白血浆加入对照品和内标、空白血浆和Beagle犬服药后血浆加内标的色谱图进行比较。烟酸的保留时间为3.070 min，甲硝唑的保留时间为9.522 min，血浆内源性物质及其他杂质基本不干扰样品的分离测定，色谱图如图1一A、B、C所示。对照品质谱图见图2一A，内标甲硝唑质谱图见图2一B。

5 标准曲线制备及检测限

取Beagle犬空白血浆9OμL，精密加入不同浓度的烟酸标准液10μL，使血浆烟酸浓度分别为0.2003，0.5008，1.002，2.003，5.008，10.02，50.08。100.2，200.3，250.4μ g/mL，按样品预处理方法进行处理后进样分析，以烟酸浓度为横坐标，烟酸和内标峰面积比值为纵坐标，做线性回归，得回归方程为：Y=0.0101C+0.0009，r=0.9996，浓度(0.2003～10.02μg/mL );Y=0.0094C+0.0245，r=0.9995，浓度(5.008～250.4 μg/mL )。结果表明血浆中烟酸在0.2003～250.4 μg/mL 浓度范围内有良好的线性关系。最低检测限为50.08 ng/mL。

6 回收率及精密度试验

取空白血浆，配制烟酸血浆浓度分别为0.2003，5.008，50.08，200.3μg/mL 的血样数份，按前述样品处理方法进行处理，取5 进HPLC—MS分析，以随行的标准曲线计算方法回收率。日内平行做5次;隔日做5次。分别计算日内、日间差异及回收率。结果见表1。

7 稳定性试验

取低、中、高4个浓度的质控样品(血浆浓度分别为0.2003，5.008，5O.08，200.3μg/mL )，冷藏于一20℃环境中，分别于0，1，2，3，7，14 d测定各浓度血浆样品的浓度，结果低、中、高4个浓度质控样品测定的RSD分别为3.31% ，3.14% ，2.54% ，3.22% 。说明血浆样品在一20℃冷藏14 d是稳定的。

8 Beagle犬血浆样品的测定

健康Beagle犬6只，体重8—9 kg，购于浙江中医学院Beagle犬生产基地，预饲养2周，单笼饲养，供给充分的水和食物。在服药前禁食12 h，次晨空腹口服相应药物，服药后不吃食物，2 h后自由饮水。每组服药前取空白血，单剂量给予烟酸片(1O片，相当于烟酸1000 mg)，在给药后5，1O，2O，3O，45 min及1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，7，8 h自犬后肢取静脉血2.0 mL。血样用肝素抗凝，3000 r/min 离心15 min分离血浆，于一20℃保存备用。血浆样品照“3”项下操作，取5μL进HPLC—MS分析，以随行的标准曲线计算含量。平均血药浓度一时间曲线见图3。其血药浓度一时间数据用DAS ver1.O(Drug and Statistic for Windows)软件计算，主要药动学参数如表2所示。

9 讨论

有关血浆中烟酸的测定方法国内外主要是采用离子对高效液相色谱法 。本实验采用高效液相色谱一质谱联用测定血浆中烟酸药物浓度的方法，选用ESI源选择性检测(SIM)烟酸和内标124.1及172.2准分子离子，具有较高的灵敏度和专属性;高效液相色谱一质谱联用具有色谱分离与质谱分离的双重功能，可以依靠质谱的分辨能力区分不同物质的色谱峰，抗干扰能力强，同时本实验采用梯度洗脱的方法使血浆中其他干扰物的出峰提前，从而缩短了样品的分析时间，可以满足本实验低浓度药物测定及药动学、生物利用度研究的需要。

参考文献

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