HPLC-MS法测定人血浆中米氮平浓度以及药代动力学研究

作者:冯芳，田勇，张正行

摘要：目的：建立人血浆中米氮平浓度的HPLC—MS分析方法，用以测定健康受试者口服米氮平制剂后的血药浓度，估算受试制剂和参比制剂的药代动力学参数，评价两种制剂的生物等效性和相对生物利用度。方法：血浆中加入内标地西泮后，环己烷提取，HPLC—MS分离、分析。色谱系统：Shimadzu ODS柱(150 toni x4.6 mm)，甲醇一醋酸铵溶液(0.01 mol/L )(75：25)为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃。质谱检测方式：SIM。结果：米氮平的线性范围为0.2—120 ng/ mL (r=0.9992)，最低检测浓度达0.1 ng/mL，提取回收率≥85%。测定20名健康志愿者单剂量交叉口服试验制剂与参比制剂后的血药浓度经时过程，受试制剂和参比制剂的主要药代动力学参数：Cmax(71.53±10.5)ng/mL 和(73.48±17.8)ng/mL;Tmax (2.0±0.8)h和(1.9±0.7)h;tl/2(22.33±2.05)h和(22.97±3.56)h，无显著性差异;受试制剂的相对生物利用度为(101.3±16.2)%。结论：本法专属、准确、灵敏。统计学结果表明受试制剂和参比制剂生物等效。

HPLC-M S Determination of Mirtazapine and Its

Pharmacokinetics and Bioequivalence in Human Plasma

FENG Fang，TIAN Yong，ZHANG Zheng—xing

Abstract ：Objective：An HPLC—MS method was established for the study of pharmaeokineties and bioequivalence of mirtazapine in human body.M ethod：Diazepam was used as internal standard.After adding diazepam，the plasma samples welt~extracted with eyelohexane and determined by HPLC—MS.The separation Was carried out on a Shimadzu VP—ODS column(150 mm x4.6 mm，packed with 5 Cl8 silica RP particle)at 30 oC.The mobile phase Was methanol一0.01 mol/L～am monium acetate(75：25).running at a flow rate of 1.0 mL/min.HPLC — MS Was performed in the selected ion monitoring(SIM)mode.A randomized crossover design Was performed in 20 healthy volunteers.In the two study periods，a single 30 mg dose of each capsule Was administered to each volun—teers.Result：The linear calibration CUl‘Ve was obtained in the concentration range of 0.2—120 ng/mL (r=0.9992).The detection limit of mirtazapine in plasma Was 0.1 ng/mL.The average recovery Was more than 85%.Cmax of mirtazapine in blood for the test and reference formulations are(71.53±10.5)ng/mL and (73.48±17.8)ng/mL at(2.0±0.8)h and(1.9±0.7)h respectively;tl/2(22.33±2.05)h and(22.97±3.56)h respectively.The relative bioavailability of the test formulation Was(101.3±16.2)%.Condusion：The assay Was proved to be sensitive.accurate and convenient.Th e two form. ulations were bioequivalent.

Key words：mirtazapine;HPLC—MS;plasma concentration;bioequivalenee

米氮平是一种新型抗抑郁药，通过拮抗中枢自身及异体的肾上腺素 受体，增加去甲肾上腺素及5一羟色胺的释放而产生抗抑郁作用，具有较好的耐受性，且几乎无抗胆碱作用，治疗剂量对心血管系统亦无影响。文献报道的人血浆中米氮平的测定有高效液相色谱一荧光检测法 、高效液相色谱一紫外检测法 。这些方法或需特殊的色谱固定相或血浆样品处理采用毒性较大的甲苯为提取溶剂，灵敏度低、分析时间长。高效液相色谱一离子阱检测法虽具有较高的分析灵敏度，但采用SRM检测方式和特殊的色谱柱，色谱峰形的对称差，血浆样品的处理过程烦琐。考虑到临床生物样本量大、稳定性差、浓度低、专属性要求高的特点，本文经试验，首次建立了经简单液一液相萃取后，测定人血浆中米氮平的HPLC— MS分离、分析方法，检测方式：SIM。对该方法的评价结果显示：方法的回收率高，分析时间短(3.5min/样)，最低检测浓度可达0.1 ng/mL，适用于米氮平药物的临床监控、药代动力学和生物利用度、生物等效性研究。

1 实验方法

1.1 仪器：HPLC—MS联用系统：Waters Alliance2690一Micro Quattro Micro MSD联用系统：含四元高压泵、在线真空脱气机、恒温自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口。Masslynx V3.5数据处理系统。

1.2 药品与试剂：米氮平片为国内某公司研制(批号：030201，规格：15 mg每片)，对照片为欧加农(荷兰)公司生产(批号：575365/587545，规格：30 mg每片)。米氮平对照品、地西泮对照品由某公司提供，纯度1>99% 。甲醇为色谱纯(Tedia公司，美国)，环己烷和醋酸铵均为分析纯(南京化学试剂厂)，水为纯净水。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件：色谱柱：Shimadzu VP—ODS(150 mln×4.6 mln，5 );Phenomenex预柱ODS(4

mm×3 mm);流动相：甲醇一醋酸铵水溶液(0.01mol/L )(75：25);流速：1.0 mL/min;柱温：30℃ 。

1.3.2 质谱检测参数离子极性：正离子;离子化方式：电喷雾离子化;检测方式：选择性离子检测(SIM)，米氮平：m/z266.5[M+H] ，地西泮：m/z285.5[M+H] ;传输电压：50 V;干燥气流速：300L·h～;裂解气温度：350℃ ;毛细管电压：3.56 kV。

1.4 样品制备

1.4.1 标准溶液的配制：精密称取米氮平对照品适量，甲醇溶解，制得浓度为100/mL 的贮备液，阴凉处保存。临用前以流动相稀释成各种浓度的米氮平对照品溶液。

精密称取地西泮对照品适量，甲醇溶解并稀释定容，制得浓度为100μg/mL 的贮备液，阴凉处保存。临用前以流动相稀释，制成浓度约1μg/mL 地西泮标准溶液。

1.4.2 血浆样品的处理：经试验，确定血浆样品处理过程如下：血样置试管(肝素化处理)中，立即于一3O℃冷冻保存。测定时，精密吸取血浆0.5 mL置于10 mL具塞离心管中，精密加入内标标准溶液15 L，混合均匀后，加入0.5 mol/L NaOH溶液100 L，漩涡10 S，加环己烷3.0 mL，涡旋提取3min，台式离心机4000 r/min 离心10 min，分取环己烷层2.5 mL，45℃水浴中氮气吹干。残留物以150 L流动相溶解，高速离心10 rain后，取上清液20 L HPLC—MS分析，测定m/z 266.5(米氮平，[M+H] )，m/z285.5(地西泮，[M+H] )的峰面积。

1.5 药代动力学和生物等效性研究

1.5.1 受试者选择20名健康男性志愿受试者，年龄为19—25岁，体重5O一75 kg，身高164—189cm。常规体检及生化检验结果证明：血、尿常规、肝、肾功能、心电图均无异常，乙肝表面抗原检查为阴性(表6)。受试前2周及试验期间停止服用任何药物，试验期间忌烟、酒，统一饮食。受试前对试验目的与要求完全了解，并由志愿者签署知情同意书。试验经南京军区总医院国家药品临床研究基地伦理道德委员会同意后进行。

1.5.2 试验方案

采用双周期两制剂交叉试验设计。20名男性健康受试者随机分为A、B两组，第一周期分别口服受试制剂和参比制剂，试验结束后，间隔14天清洗期，再相互交叉进行第二周期试验。受试者于试验前两周和试验期间均不饮用酒类和咖啡类饮料，试验前禁食过夜约12 h，次日晨(7：o0)空腹服用试验制剂(30 ms/2片)或参比制剂(3Oms/片)，200 mL温开水送服。受试者于服药后4 h进统一餐。受试者于服药前及服药后0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3，4，6，10，24，48，72，96和120 h，分别采血4.0 mL于肝素抗凝试管中，3500 r/min 离心15 min，分离出血浆，一3O℃冷冻保存、待测。

1.5.3 临床观察内容

试验工作在一期临床观察室中进行，受试者由临床医生监护，受试期间发生任何不良反应均及时处理和记录。

2 结果

2.1 方法的专属性：在上述色谱条件下，米氮平和地西泮峰形良好，米氮平和地西泮的保留时间分别为3.1 min和2.8 min(图1)，血浆中杂质不干扰样品测定。

2.2 线性关系及灵敏度：取离心管数支，于0.5 mL空白血浆中精密加入不同量的米氮平标准溶液，配成浓度为0.2，0.6，2.0，10.0，20.0，40.0，80.0，120.0 ng/mL 的标准血浆，按“血浆样品的处理”项下操作，记录峰面积。以样品面积与内标面积(A/s)的比值对浓度(C)作直线回归。得回归方程：f=0.0176 C+0.0006 r t>0.9992显然，在0.2—120.0 ng/mL 范围内，质谱响应值和浓度线性关系良好。米氮平在血浆中的最低检测浓度为0.1 ng/mL。

2.3 回收率试验

对照样品：取离心管数支，不加血浆，精密加人不同量的米氮平对照品溶液，使其浓度分别为2.0，20，80 ng/mL，并加人1 /mL 的内标溶液15L，混合后将溶剂挥干，残渣用150μL流动相涡旋溶解，20μl 进人HPLC—MS分析。记录色谱图，并计算米氮平峰面积与内标峰面积的比值。回收率样品：于离心管中加人0.5 mL空白血浆，精密加人不同量的米氮平对照品溶液，使其浓度分别为2.0，20，80 ng/mL，混合均匀后，加人0.5mol/L NaOH溶液100μL，漩涡10 s，加环己烷3.0 mL，涡旋提取3 min，于4000 r/min 离心10min，取上清液2 mL转移至另一离心管中，加人1μg·mL 的内标溶液15 L，混合后在40℃水浴上用氮气流吹干，残渣用150 流动相涡旋溶解，20μl进入HPLC—MS分析。计算米氮平峰面积与内标峰面积的比值。

2.4 精密度试验：取离心管数支，精密加人0.5mL空白血浆后，再精密加人不同量的米氮平对照品溶液，配成浓度为2.0，20，80 ng/mL 的含药血浆，按“血浆样品的处理”项下操作，记录样品面积与内标面积(A/s)的比值。测定日内精密度和5天内的日间精密度。

2.5 药代动力学研究 ：受试制剂和参比制剂给药后的血药浓度一时间曲线见图2，按“1.6”部分内容估算的主要药代动力学参数见表3。供试片的相对生物利用度为(101.3±16.2)% 。

3 讨论

3.1 由于人体血浆中米氮平的浓度较低，且存在着较大的个体差异，采用HPLC—UV法测定时，有时可观察到少量杂质干扰其低浓度测定，有时则无法检测到样品。为保证临床大量、且复杂生物样本分析的专属性和准确性，鉴于HPLC—MS法灵敏度高、具有二次分离作用的优势，本文研究并建立了米氮平人血浆样本高效液相色谱/质谱联用分析方法，该方法对目标化合物及其内标同时进行选择性离子检测(m/z266.5及m/z285.5)，空白血浆无杂质干扰，最低检测浓度可达0.1 ng·mL～，完全满足临床血药浓度监测的要求。

3.2 在电喷雾离子化状态下，用扫描方式测定米氮平的质谱，结果表明：[M+H] 离子(m/z 266.5)的响应明显高于碎片离子，因此m/z 266.5离子被选择作为米氮平的检测离子。同样的测定还表明：[M+H] 离子(m/z 285.5)为地西泮检测离子最佳离子。进一步优化质谱条件，分别在传输电压30，40，50，60 V，干燥气流速200，300，350，400 L/h，裂解气温度250，300，320，350℃条件下考察米氮平[M+H] 离子(m/z 266.5)的响应，结果表明：传输电压50 V、干燥气流速300 L/h、裂解气温度350℃的条件下，米氮平准分子离子响应最大。

3.3 米氮平分子结构中含多个苯环，且含有多个氮原子，故在C18柱上有较长保留，易形成拖尾峰。本文尝试采用甲醇一醋酸铵水溶液(0.01 tool/L )(75：25)、甲醇一水(含0.5%醋酸，0.5% 三乙胺)(75：25)等体系为流动相，发现甲醇一醋酸铵水溶液(0.01 tool·L )(75：25)体系产生分离效果最佳。在所选的色谱条件下，地西泮因峰形对称，保留时间适宜，且血浆中无杂质干扰，而被用作分析测试的内标。

参考文献

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