奥运促红细胞生成素（EPO）的血液检测方法

◎ 周 刚

摘 要：重组人促红细胞生成素(rHuEPO)被禁止用于提高运动员的成绩，但是用常规的检测方法很难区分内源性EPO和外源性EPO。运动员使用EPO后，会导致其一些血液参数的变化，通过对这些血液参数的检测，可以间接判定运动员是否使用了EPO。本文综述促红细胞生成素的血液检测方法的研究进展，明确指明了 EPO血液检测的原理和方法，并重点讨论了转铁蛋白受体和网织红细胞参数等指标的检测原理和方法，以及悉尼奥运会的EPO血检方法。

关键词：促红细胞生成素，重组人促红细胞生成素，血检。

1.EPO和rHuEPO

增加红细胞量对于提高运动成绩的好处已被广泛的报导。就目前而言，增加血红细胞量的途径主要有：1.持续的艰苦训练或高原训练;2.采用血液回输技术;3.注射促红细胞生成素。

毫无疑问，即使在高水平运动员中，靠持续的艰苦训练或高原训练，要大幅度地提高自身固有的血液浓度和血红蛋白含量是很困难的。于是，有人便另辟"捷径"，企图通过采用不正当手段来实现上述目的。二十世纪七十年代，一些长跑运动员曾在慕尼黑(1972)和蒙特利尔(1976)两届运动会上利用自体输血的技术参加比赛，有的运动员还取得了金牌 [1]。随着检测技术的发展，用常规的尿检方法已能很容易地检测出血液兴奋剂的滥用，于是，一些运动员便转向使用其它尿检不易查出的兴奋剂，这其中便包括 EPO[2]。而今，促红细胞生成素已成为目前国际体坛"最具欺骗性的药物"。

人体的肾脏能产生一种红细胞生成酶(erythrogenin)，这种酶作用于肝脏所产生的促红细胞生成素的前身(一种α-球蛋白)促红细胞生成原(erythropoietinogen)，它们在血浆中转变成人促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)[3]。最近发现，肝细胞和巨噬细胞也能产生EPO。EPO属酸性糖蛋白，它与红细胞前体细胞表面EPO受体结合，促进其血红蛋白的合成，使之增殖分化成红细胞，从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。它的表达有其严格的组织特异性，同时严格受体内氧分压的控制。正常情况下人血液中EPO水平保持在4×10-3~24 ×10-3U/mL，再生障碍性贫血患者因组织严重缺氧，血液中EPO水平可高达10U/mL[4]。

早年从再生障碍性贫血病人的尿中、胎肾细胞的培养液中可获得较多的EPO。1985年应用基因重组技术，获得重组人EPO (Recombinant Human Erythropoietin，rHuEPO)，有了大量纯品EPO的问世，使EPO得以在临床上广泛应用[5,6]。rHuEPO与 EPO的作用极为相似，可以明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量，从而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量。在使用rHuEPO4-7天后， rHuEPO已恢复正常水平，应用常规检测的色谱学方法无法查出，而其功效还可持续四周之久，这正是有氧耐力运动员所期望的。因此，在2 0世纪80年代，人工合成的rHuEPO开始被用作体育训练及竞赛中的辅助药物，个别人为了追求良好的训练及比赛成绩并逃避药检，越来越多地服用此类药物，rHuEPO也被直接称为EPO。然而，rHuEPO的滥用可导致血小板功能亢进、高血压、中风等疾病，严重者甚至死亡。有鉴于此，1989年国际奥委会医学委员会将EPO等4种人工合成的肽类激素正式列为禁用药物。

2.rHuEPO的血液检测原理

由于检测技术的原因，EPO在体能类运动项目中的滥用一直无法进行有效的控制。有三个方面的因素限制了EPO的检测，这些因素是：其一， rHuEPO与内源性EPO的分子结构极为相似。EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸性糖蛋白，分子量为34000D(道尔顿)，而 rHuEPO的分子量为30400D，也是单链糖蛋白[7]。现在还没有技术能从统计学上鉴别、分离和确定rHuEPO的数量[8];其二，rHuEPO 与内源性EPO相似的临床效果。其功能都是刺激造血祖细胞分化为红细胞;其三，rHuEPO的平均半衰期大约为6小时，大多数rHuEPO在1-3天内被身体清除，然而其功效仍可以持续四周[9,10]。因此，按常规的尿检或血检方法很难直接检测出rHuEPO的存在，更少有机会通过血清的EPO水平检测出滥用者，尤其是在竞赛期间。

研究表明，在停止注射EPO四周后，体内EPO恢复到正常水平，甚至低于正常水平[9,10,]。这就是说，为了保持其有效性，兴奋剂使用者不得不在赛前四周内注射rHuEPO，而最佳的使用效果是在赛前两周内注射。这就给兴奋剂检测者提供了一个检测出当前或最近使用了rHuEPO的运动员的机会。

从这个思路入手，一些研究表明：rHuEPO的使用不可避免地会导致血液中一些生理生化指标的改变，这些指标包括可溶性转铁蛋白受体(soluble transferrin Receptor, sTfr )和与血红细胞及网织红细胞相关的各种参数，如红细胞压积(hematocrit ，Hct)，血红蛋白含量(Haemoqlobin,Hb)和网织红细胞计数(reticulocyte count, #retic)等等[2,8,11,12,13,14]。依赖于对这些间接指标的检测，与没有用rHuEPO的正常人的指标相比较，可用于查明运动员当前或近期滥用rHuEPO，这是目前EPO检测的一个现实思路。

国际自行车联合会曾以红细胞压积(Hct)超过50%为界线来判定使用了EPO[15]，而国际业余滑冰组织则以血红蛋白(Hb)超过 18.5g×dL-1来判定明显地使用了EPO。然而，Hct 和Hb是相当粗糙的血液特征检测指标。血液特征受脱水，心情和运动方式的影响，并且50%的限制不排除个别优秀运动员有自然的高Hct。

早期的研究还有检测滥用rHuEPO的间接指标Tfr[14,16,17]。一项最近的研究指出，在最后一次使用rHuEPO后的25 天内，Tfr还高于正常水平。一项运动员使用rHuEPO的药动学研究表明，尽管用药后4到7天内EPO已回落到正常水平，但直到用药后第14天，许多血液学指标还高于正常水平[11]。

另外，最近的几项关于rHuEPO的研究报道，网织红细胞绝对计数(#retic)，每个网织红细胞的血红蛋白含量(CHr)，网织红细胞的血红蛋白总量(RetHb)，血红细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率(RBCHb：RetHb)等指标也可做为检测rHuEPO的间接指标[8,10,11]。国内外现在已有大量关于EPO检测方法的报道，下面重点对EPO的血液检测方法做一综述。

3.rHuEPO的血液检测方法

3.1转铁蛋白受体(Transferrin Receptor, Tfr)

Tfr为一双糖蛋白，分子量为2×94000D，实际上存在于所有细胞的表面上。但成人中，约有80%存在于骨髓成红细胞中。当红细胞受到EPO的刺激时，Tfr会将与其结合的血液中富含的转铁蛋白中的铁转移到血红蛋白的卟啉中。随着红细胞的成熟，Tfr及Tfr的一些碎片将被释放进入血液循环。因此，以免疫方法定量测定血中的Tfr及其碎片可以提供一个可能的方法以检测外源EPO的使用。国内外许多相关的实验都证实了Tfr作为检测 rHuEPO的间接指标的可靠性[11,13,14,17]。以下是一些这方面的实例。

加拿大的Gareau等人报道：以50~100IU/kg.bw的EPO进行每周三次的皮下注射后，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定给药组(n=24)血清中的Tfr的浓度为3135±312ng/mL, 而对照组(n=6)的血清浓度为2195±225ng/mL(P<0.001)[16]。在Gareau等人的另一项实验中也得出同样结果， rHuEPO的滥用导致Tfr的延迟性增加和fr(铁蛋白)的延迟性减少，Tfr/fr升高。作者提出，可用Tfr和Tfr/fr作为检测运动员滥用 rHuEPO的指标[14]。

方子龙等给6名健康青年男性受试者皮下注射rHuEPO，剂量为30IU/kg体重，每周3次，持续4周，采用ELISA进行指标测定。结果表明，注射rHuEPO能提高血清EPO浓度和转铁蛋白可溶性受体Tfr的浓度;在停药后1个星期左右的时间内，Tfr浓度仍保持在较高水平。结果提示：血清EPO和Tfr浓度有可能作为rHuEPO检测的指标[18]。

法国的Audran等人也做了相关的实验：给9名运动员每人每天皮下注射50IU/kg的rHuEPO，持续26天。分别于用药期 10，14，17，24天和用药后1，3，7，14，25天抽取血样分析。结果表明，rHuEPO的滥用，使运动员的有氧能力明显提高，同时，用药期间及停药两周内Tfr和Tfr/fr均显著升高。作者提出，以Tfr高于10μg/mL 和Tfr/fr高于153，来判定是否使用了rHuEPO[11]。

多年来，国外在Tfr的检测方面已做了大量的研究，可以肯定的是，Tfr已成为目前EPO检测中最为可靠，最为常用的指标。

3.2网织红细胞参数

网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞。因其胞质内尚存留多少不等的嗜碱物质 RNA，经煌焦油蓝、新亚甲蓝等活体染色法染色后，嗜碱物质凝聚成颗粒，其颗粒又可联缀成线，而构成网织状，此种红细胞即网织红细胞 [19]。滥用rHuEPO将导致血液中的网织红细胞的参数变化。这些参数包括网织红细胞绝对计数(#retic)，每个网织红细胞的血红蛋白含量(CHr)，网织红细胞的血红蛋白总量(RetHb)，血红细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率(RBCHb：RetHb)[8,11]。

澳大利亚的Parisotto等人对此进行了深入的研究。在一项实验中[8]，他们以自行车、游泳、赛艇、田径和越野滑雪等项目的国家级和世界级运动员(n=155)为对照组，对照组又分为模拟高原训练组和高原训练组;以健康的非运动员男性(n=23)为实验组，实验组又分为三组，A组在1、4、7、10天每天注射300U/kg rHuEPO，B组在1、5、9天每天注射400U/kg rHuEPO，C组在1、10天每天注射600U/kg rHuEPO。在第11天采样，采用流量血细胞计数法进行分析。实验结果显示：注射rHuEPO的非运动员的网织红细胞参数明显地不同于正常训练的优秀运动员的，也不同于在高原或模拟高原训练的运动员的。注射rHuEPO的非运动员的#retic增加近三倍(注射rHuEPO前后的#retic 分别为25-53×109/L和193-260×109/L)，RetHb增加近两倍，同时，RBCHb：RetHb明显降低。作者认为，最好的检测rHuEPO的指标是#retic，其次是RetHb和RBCHb：RetHb。据此检测的失误率在10000例被试中不超过7例(95%置信区间)。作者建议可用网织红细胞参数(#retic，RetHb，RBCHb：RetHb)作为检测优秀运动员当前或最近滥用rHuEPO的间接指标。另外，这项实验同时也说明了高原训练和模拟高原训练不影响这些指标的可靠性。

上述Audran等人的实验也检测到，从注射rHuEPO到停止使用rHuEPO的25天内，网织红细胞参数都发生显著性变化(P<0.01)[11]。

3.3悉尼奥运会的EPO血检方法

1999年澳大利亚体育学院(AIS)成立了"EPO2000"科研攻关组，并协同澳大利亚体育运动兴奋剂检测实验室(ASDTL)联合进行一项注射EPO的课题，该课题后来被命名为"EPO2000"研究计划[22]。这项研究课题后来又有许多国家和地区的专家共同参与攻关(包括澳大利亚、法国、加拿大、挪威和中国)，上述研究者Parisotto，Gareau，Audran等都参与了该计划。

国际奥委会执委会在2000年8月28日正式通过了在悉尼奥运会上采用"EPO2000"研究的EPO血检和尿检方法的决定。其中澳大利亚科学家的血检研究成果意义更加重大，因为这是奥运会历史上引进的第一项血检技术，它突破了尿检技术只有在服用EPO后三天内检测才有效的局限性(尿检方法为法国科学家研究成功)。

澳大利亚体育学院Parisotto等人2000年发表在血液学杂志上的实验报告[20]成为国际奥委会最终同意在悉尼奥运会进行血检的重要参考性文献 [22]。该实验将27名运动员分为三组：EPO+IM组(n=10)，注射rHuEPO和铁;EPO+OR组(n=8)，注射rHuEPO和口服铁;安慰剂组(n=9)。用药期为三周，每组被试在用药期和用药后四周内的血液学和生化指标被检测。实验者从检测的众多指标中筛选出5个指标，它们是：Hct, 网织红细胞压积(reticulocyte hematocrit, RetHct), 巨红细胞百分比(percent macrocytes, %Macro)，血清EPO和sTfr。实验设计了两种分析模型： ON-model和OFF-model。ON-model应用于rHuEPO使用期，在rHuEPO使用期的最后两周，通过综合分析上述五个指标，能够检测出94-100%的rHuEPO使用者;OFF-model应用于停药后，综合分析RetHct，EPO和Hct，在停药后的12-21天，能够检测出 67-72%的rHuEPO使用者。由此证明，这五项指标可用于检测当前或最近滥用rHuEPO的运动员。

澳大利亚和中国合作也做了相关的实验。在这项实验中，Parisotto等人在悉尼和北京两地分别对49名和24名运动员进行了EPO 实验。每名被试每天被注射50 IU/kg rHuEPO，持续25天。结果显示，两地被试血液中的上述五项指标在注射rHuEPO期间及注射后4周内均有异常变化。作者认为，通过检测这五项指标，完全可以准确地查出数周内滥用rHuEPO的运动员[21]。该实验的另一意义在于补充了黄种人(人种)和中国人(民族)的EPO检测数据。

综上所述，采用检测rHuEPO导致的血液中一些"间接指标"的变化来判定优秀运动员当前或最近滥用rHuEPO是行之有效的方法，尤其是综合多项指标来进行分析，并结合尿检时，对于数周内使用rHuEPO者的检测，其准确率几近100%。然而，尽管检测EPO的方法已日臻完善，但对于高原训练与内源EPO的产生，不同地域和不同人种红细胞数量的不同等方面研究成果还相对缺乏，这限制了EPO血检技术的应用，这也是悉尼奥运会最终采用尿检与血检共同使用，而不单以血检结果判定滥用rHuEPO的原因之一。如何解决这些难题，使EPO的检测方法准确而无隙可击将是兴奋剂检测工作者进一步研究的课题。

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作者简介：周刚，重庆市人，1967年生，华东师范大学体育与健康学院运动科学专业2003级博士生，导师许豪文教授。