【Zeno SWATH DIA】基于计算机模拟库的Library-free分析策略应用于蛋白质鉴定

对不同样品组进行准确的蛋白质定量是理解生物学的关键，但首先需要在样品中鉴定到该蛋白质。因此，对生物样品中蛋白质的鉴定仍然是一个重要的工作流程。

本研究应用传统 DDA 工作流程（Zeno DDA）与 Zeno SWATH DIA 工作流程进行蛋白质、肽段鉴定。后者使用人类序列理论数据库进行蛋白质鉴定。在 45 分钟和 10 分钟微升液相梯度下，比较两种工作流程在蛋白质和肽段的鉴定水平。

● 样品准备：人 K562 细胞裂解物的酶解产物，来自SWATH Acquisition performance kit (SCIEX)。进样量范围为 12.5 ng - 400 ng。

● 液相方法： ACQUITY UPLC  M-Class液相系统（Waters），分析色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，液相梯度：10 min, 45 min。

● 质谱方法：ZenoTOF 7600系统2台，两种采集流程：Zeno DDA、可变窗口Zeno SWATH DIA，样品平行采集三次。

● 数据处理： Zeno DDA数据用OneOmics™软件包中ProteinPilot™应用程序，使用人类理论数据库进行搜库。Zeno SWATH DIA数据使用DIA-NN[1]软件处理。

分为计算机模拟谱库（Library-free）和有谱图库两种分析，其中谱图库使用两种数据库：Pan Human Library[2]和ProteinPilot™软件搜索的人类理论数据库构建样本谱图库。

主要结果

1. Zeno DDA与Zeno SWATH DIA

在蛋白质鉴定的比较

在12.5ng - 400 ng进样量范围内，在相同进样量条件下，Zeno SWATH DIA鉴定的蛋白质数量约为Zeno DDA的 2 倍， 2 台 ZenoTOF™ 7600 系统测试结果一致。进一步进行蛋白质种类比较，Zeno SWATH DIA鉴定的蛋白质几乎覆盖了Zeno DDA 鉴定到的蛋白质。

图1. 45min液相梯度下，Zeno SWATH DIA

和Zeno DDA蛋白质和肽段鉴定比较结果

注：左图为蛋白质鉴定结果，右图为肽段鉴定结果

图2. Zeno SWATH DIA和Zeno DDA 鉴定

蛋白质的重叠情况

2. Zeno SWATH DIA数据使用Library-free

处理策略和样本谱图库处理策略的比较

相比于通过MS1数据进行定量的Zeno DDA策略来说，Zeno SWATH DIA策略可产生丰富的MS/MS数据，因此可获得更可靠、更明确的定量数据。使用 Zeno SWATH DIA 工作流程时，无论使用谱图库还是Library-free的数据处理策略，定量CV < 20%的蛋白质均占总鉴定蛋白质约90% 。三种不同数据处理方法的鉴定蛋白质数量相似，该结果显示了Library-free处理方法的能力。

图3. Library-free策略和 2 个实验数据库策略

获得的鉴定蛋白质结果的比较

随后比较Library-free处理生成的结果与使用谱图库处理的结果，维恩图（图 4）显示二者得到的蛋白质鉴定信息非常相似，进一步增加了Library-free方法的可信度。

图4. Zeno SWATH IDA数据使用Library-free方法

和有数据库方法鉴定蛋白质的重叠情况

3. 使用更快速的液相梯度

使用快速 10 min液相梯度重复本研究，以确认 Zeno SWATH DIA 工作流程在更快的液相梯度中鉴定蛋白质数量的提升倍数。相比于 Zeno DDA 方法， 45 min液相梯度，Zeno SWATH DIA 方法蛋白质鉴定量提升约2倍（图 5）。随着液相梯度加快， 使用Zeno SWATH DIA可获得更大蛋白质鉴定增益，蛋白质鉴定数量增加到 2.5倍 -3 倍。因此，当进行大样本分析时，更适合选用Zeno SWATH DIA工作流程。

图5. 10 min和45 min液相梯度，

蛋白质和肽段鉴定数量的比较

文献：

[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.

[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.