人物专访 | 牛津大学Roman Fischer博士谈临床蛋白质组学与组学分析

目前，包括监测疾病的药物靶标和生物标志物在内，人们对大规模临床蛋白质组学工作流程的需求正在迅猛增长。

牛津大学Target Discovery Institute发现蛋白质组学团队负责人Roman Fischer博士所在的实验室向牛津大学的研究人员以及国内外合作者提供有关实验设计、样品制备和高级液相色谱-质谱（LC-MS）工作流程的建议与分析。

该实验室由Roman Fischer博士领导，他自己的研究兴趣在于方法开发和蛋白质组学工作流程的优化，以增强从有限的样品中获得无限的结果。Fischer博士作为参与者之一，参加了迄今为止最全面的癌症蛋白质组的分析流程开发。

Roman Fisher博士及他的团队成员，摄于牛津大学实验室。该实验室配置了连接Evosep One液相的timsTOF Pro。

不久前Technology Networks与Fischer博士进行了交谈，了解到更多研究人员在临床蛋白质组学领域面临的挑战，以及4D蛋白质组学工作流程如何提高他的实验室工作。（https://www.technologynetworks.com/）

　Q1 您认为当前临床蛋白质组学领域最近最激动人心的突破是什么？

Roman Fischer：在技术方面，最大的突破之一是现在能够凭借高通量和高稳定方法每天对100个甚至更多的样品进行鸟枪法蛋白质组学研究，这是不久前才实现的一步巨大的变化。我们需要意识到，这消除了一个瓶颈但又创建了另一个瓶颈，例如人们如何处理如此大数量的生物样本以及进行数据分析。由于仪器分析增加了通量和稳定性，我们必定会看到更多使用蛋白质组学作为主要判断依据的临床研究，虽然这项研究早就应该进行了。

　　Q2 请您分享一下更多有关您开发用于临床蛋白质组学的高通量样品处理的经验？

Fischer：我会将样品处理分成不同的子类别。首先是样本本身，这可能会在临床分析环境中发生很多变化。其次是样品处理，这可能需要将1000多个样品从采样管转移到可以在液体处理平台中使用的容器中。这导致了一个新的瓶颈，因为它可能涉及使用不同的ID系统打开1000个不同类型的螺帽样品管等。然后是用于质谱分析的高通量样品制备，它必须具有可重复性，而且非常简单且具有成本效益，同时允许自动化操作。目前，每个类别都产生并建立了尚不完全标准化的多个挑战和流程。

　　Q3 您参与了一个迄今为止最全面的癌症蛋白质组学研究之一的研究项目。是什么原因促使您参与这个项目的？您的个人观点是什么？

Fischer：这项研究是纯粹的技术练习。虽然从单个细胞系中生成近14000个蛋白质的深度蛋白质组，但是我们获得数据中的亮点在于，随着序列覆盖率显著提高，我们可以将蛋白质组拆分为具有独特性的蛋白质。在这项实验之前，人们已经成功尝试了多种酶对蛋白质进行酶解，但是我们仅使用2种酶（胰蛋白酶和弹性蛋白酶），仅用了75个小时的仪器时间就成功做到了这一点。

　　Q4 您在研究中主要采用哪些技术？

Fischer：在我的实验室中，我们主要关注基于质谱的蛋白质组学定量分析。这包括使用SILAC，PRM，DIA，TMT，AQUA等技术。目前，我们也正在开发将激光捕获显微切割与蛋白质组学相结合的方法，期望获得生物组织内的空间和细胞类型高分辨率。这就要求我们自己开发基于SP3的样品制备方法，但是我们也将继续努力以最小的材料代价实现最大化的蛋白质组深度分析，同时将通量提高到每天100个样品甚至更多，同时不会影响深度蛋白质组分析。

　Q5 与3D蛋白质组学相比，基于TIMS和PASEF的4D蛋白质组学还可以获得哪些其他信息，为什么这对临床研究有益？

RF：许多DIA和数据库方法都将保留时间和质量用于匹配算法。这些技术可能会在复杂样品分析中遇到具有相似保留时间和相似分子量的异构肽，从而导致蛋白质鉴定和定量信息不准确。离子淌度提供的额外维度则可以有效地避免相似数据导致的误差，这不仅可以更好的检测出临床样品中更多的蛋白质，还可以减轻蛋白质组学数据中缺失值的问题。使用TIMS/PASEF方法，我们可以有效地识别并定量分析样品中的更多蛋白质组分，从而增加了患者检测样品中变化的成分。

　Q6 我们看到当前蛋白质组学进一步向临床领域发展。 当前存在哪些挑战正在阻碍这一转变，我们如何克服这些挑战？

Fischer：要在临床领域取得成功，基于质谱分析的蛋白质组学工作流程必须具有成本效益、高稳定性、高通量、操作简单。此外，我们必须进行样品处理、数据分析和解析，这些要点中的每一个都严重依赖于标准化流程。我认为我们已经开始解决一些技术障碍，虽然当前仍存在一些瓶颈，但相较而言其他人使用的仪器仍操作复杂甚至无法解决问题，尤其是无法与ELISA等现有技术竞争。

另一个主要挑战是数据分析。此前的数据分析（蛋白质定性和定量分析）可以通过暴力计算解决，而现在，蛋白质组学数据在“疾病与健康”解析中正面临着巨大的挑战，因此我们需要先进的AI和深度学习算法。尽管在许多针对特定疾病的实验室中正在研究这一问题，但我想我们离真正的诊断蛋白质组学还有很远的路要走。