蛋白沉淀问题

婴幼儿乳品中含有大量的蛋白,在实际检测中,需要进行蛋白沉淀进行去除,蛋白沉淀过程对于回收率和净化结果有很大影响,如果沉淀不完全,会造成回收率下降和干扰过高:造成色谱柱的污染、堵塞,严重降低色谱柱的使用寿命。

婴幼儿食品有乳液状态的,也有固态的。液态食品传统的提取方法较为简单,通常是使用乙腈或缓冲液进行蛋白沉淀,离心后取上清液进行进一步净化。 传统的乙腈净化方法容易造成蛋白沉淀不完全。一些含脂肪较高的样品在用乙腈进行蛋白沉淀时,乙腈易将样品中的脂肪提取出来,造成提取液浑浊,回收率下降、干扰过高和色谱柱污染。

随着样品前处理技术的发展,蛋白质的去除引入了一些新的技术,如固相萃取方法、超滤膜技术。这些方法就可以很好的解决以上问题。

1 Cleanert™ MAS方法

MAS(Multi-function Impurity Adsorption SPE),即“多重机制杂质吸附萃取净化法”,该方法主要利用多官能化的复合吸附材料,以离子交换、反相、氢键等机理去除样品中的干扰物质,同时将目标物质留在样品溶液中,从而达到净化和富集的目的。

MAS方法,对于无论中性、酸性或碱性的强极性化合物均具有较好的净化效果。Cleanert™ MAS产品中的MAS-WA,MAS-A和MAS-B,MAS-A适用于酸性物质:MAS-B适用于碱性物质。MAS-WA适用于中性及两性物质。具体的选择方法为:

根据样品的极性选择洗脱溶剂,乙腈、甲醇的混合溶剂具有良好的沉淀蛋白效果,乙腈与甲醇的比例一般为9:1-1:1。如果是强极性化合物,洗脱溶剂中可以添加适量的水,水的比例不应超过三分之一,不然会引起洗脱液浑浊的现象。如果是弱极性化合物,洗脱液可以添加适量的弱极性溶剂(如乙酸乙酯、二氯甲烷等)。

再根据样品的酸碱性选择产品和进一步优化洗脱溶剂。如果是中性、酸性或碱性化合物,洗脱溶剂可以选择中性溶剂(如乙腈、甲醇混合溶剂)。如果是两性化合物,溶剂应选择碱性溶剂(如含1%NH3·H2O的沉淀溶剂)

MAS方法可以同时除去多种杂质而不吸附目标物质,具有较好的除磷脂、除蛋白效果,降低本底,提高方法的灵敏度。同时可与自动化萃取仪器兼容,便于高通量样品处理。

MAS产品中特殊的疏水性筛板可以阻挡变性蛋白质,而乙腈等用于洗脱液的有机溶剂易于通过,从而使操作简便易行。其操作步骤为:

柱管形式:

1. Cleanert™MAS管和试管放置于固相萃取装置中:

2. 每管1-2 ml乙腈活化,负压抽干:

3. 每管加入50-1000 μL样品:

4. 每管快速加入适量的沉淀溶剂(乙腈与甲醇的混合溶剂效果更好),静置3min,如果加入的样品量较大,请用振荡器振荡帮助样品与溶剂混合:

5. 加负压,溶剂从管上流下,收集于试管中。

96孔板形式:

1. Cleanert™ MAS板和96孔接收板放置于96孔板正压或负压装置中:

2. 每孔1-2 ml乙腈活化,负压抽干:

3. 每孔加入50-200μL样品:

4. 每孔快速加入适量的沉淀溶剂(乙腈与甲醇的混合溶剂效果更好),静置3min:

5. 加正压或负压,溶剂从板上流下,收集于96孔接收板中。

2 超滤膜技术

膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层、在膜的两侧存在一定量的能量差作为动力,允许某些组分透过而保留混合物中其他组分,各组分透过膜的迁移率不同,从而达到分离目的的技术。

超滤是一种能够将溶液进行净化、分离、浓缩的膜分离技术,超滤过程通常可以理解成与膜孔径大小相关的筛分过程。以膜两侧的压力差为驱动力,以超滤膜为过滤介质,在一定的压力下,当水流过膜表面时,只允许水及比膜孔径小的小分子物质通过,达到溶液的净化、分离、浓缩的目的。对于超滤而言,膜的截留特性是以对标准有机物的截留分子量来表征,通常截留分子量范围在1000~300000,故超滤膜能对大分子有机物(如蛋白质、细菌)、胶体、悬浮固体等进行分离,可以用于蛋白质的去除。