通过 CESI-MS 进行蛋白质组学分析

CESI-MS 蛋白质组学

质谱法拥有诸多功能。很多实验室都使用质谱法表征治疗性蛋白质,表征翻译后修饰,研究代谢指纹或者临床定量药物及其代谢物。不过,还有很多技术等待探索,例如 CESI-MS,这种技术可以对其他现行方法整体遗漏的分子进行鉴定和分析。

蛋白质组学
CESI 8000 Plus 高性能分离 - ESI 模块能够大大提升肽分析的灵敏度,同时扩大对更小的高极性肽的覆盖率,这些肽通常会被其他技术遗漏。在电喷雾电离期间可实现的超低流速可以降低离子抑制,且能够实现对磷酸化、糖基化和唾液酸化等翻译后修饰 (PTM) 的检测,这些修饰通常会妨碍高效电离。这种技术的高分离效率和高灵敏度能够实现对低丰度和/或低分子量肽的检测,甚至对于只有质量或电荷轻微差异的微序列变体也是如此。

CESI-MS 为蛋白质组学研究带来以下优势:

  • 对天然蛋白质组学样品进行分离和电离,便于开展自上而下的分析
  • 扩大 PTM、低分子量和亲水肽自下而上的覆盖率
  • 高分辨率分离,在低皮摩尔范围下的选择性强
  • 从 5 μL 及以下的样品体积进行多次注射

自上而下的蛋白质组学
尽管完整蛋白质质谱法 (MS) 最近取得了一些进步,这些分子的检测和分析仍然存在一些困难。当前,大多数研究都是通过输注高纯度蛋白质或通过免疫亲和性分析开展的。这主要是因为前端分离工具效率低下,这些工具可以实现对这些分子的直接分析。毛细管电泳 (CE) 可以在天然和变性条件下对蛋白质进行表征。中性毛细管表面的使用能够提升毛细管电泳分离能力,因为这种表面可以抑制蛋白质与毛细管壁之间的相互作用,且几乎能够完全消除电渗流,进而扩宽分离窗。CE 与 ESI 整合到相同设备内的单一动态流程中(被称为 CESI),仅使用一个开口毛细管即可在超低速纳流条件(~25 nL/分钟)下执行高效的蛋白质分离和电离。

例如,天然和变性条件下前列腺特异性抗原 (PSA) 的 CESI 分离可以对大量蛋白质变体进行鉴定和定量分析。天然和变性条件下的 CESI-MS 实验也能实现对 56 种糖型的鉴定和定量分析。天然条件下 CESI-MS 的去卷积分析揭示出可能有 236 种蛋白质变体,而直接输注仅能鉴定 127 种。

CESI 是一种强大的分离和电离技术,可用于对天然和变性条件下的完整糖蛋白进行 MS 分析。

  • 中性涂层毛细管可以基于结构异质性对 PSA 蛋白质变体进行分离。
  • CESI-MS 实验中装载的样品量几乎是典型 nano-LC 输注实验中的一半,而检测到的蛋白质变体的数量却是后者的两倍,展现出 CESI 作为分离和电离工具的价值。
  • 不同于稀释,不需要进行特殊的样品制备。

注意,以上不代表自上而下的蛋白质组学实验,因为我们关注的仅是一种蛋白质的蛋白质变体...

自下而上的蛋白质组学
毛细管电泳也被证明有助于开展自下而上的蛋白质组学分析。

从 Lindner 等人的工作中可以看出,CESI-MS 是一种强有力方法,无需进一步富集即可鉴定相同样品中的低丰度修饰肽。在 CESI-MS 成功鉴定的 1,371 种磷酸化肽中,49 种在两种酵母菌株中受到不同监管。使用这种方法除了发现 33,854 种独特的肽之外,还鉴定出 8,106 种乙酰化、磷酸化、去酰胺或氧化肽形式。


对肽进行的 CESI-MS 分离也显示出选定片段定量分析的强度和特定时间。
 

CESI-MS 为自下而上的蛋白质组学带来以下优势:

  • 低流速 - 由于 CESI 流速低于30 nL/分钟,电离效率得到最大程度提高,离子抑制则显著降低,可以实现对蛋白质和糖蛋白的强力电离。由于 CESI-MS 中使用一个开口毛细管,无需连接泵或构造毛细管接头。
  • 分离效率 - 毛细管电泳的出色分离效率有助于提供高度解析的肽,从而实现简化的 MS 鉴定和相对定量。
  • 小样品量 - CESI 的体积和质量要求小。可以从 5 L 或更少样品中进行多次注射。
  • 开口毛细管可以实现卓越的覆盖率由于毛细管电泳使用不带固相的开口管,所有进入的蛋白质/肽都会从毛细管中洗脱。这样可以提供全面的蛋白质组覆盖,并且几乎完全消除了样品损失或遗留。此外,没有固相 i) 可以避免柱内相互作用导致的大蛋白质/肽损失,以及 ii) 不需要对色谱柱进行清洗,从而避免了小蛋白质/肽损失。
  • 正交性 - CESI 为 LC-MS 分离方法提供了正交机制,可以对蛋白质组样品进行鉴定、定量分析和验证。

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