新型StrataQuest定量分析方法：探索胞内原生生物与宿主细胞的关系

探究宿主-病原体相互作用的特点是研究微生物与免疫学方向学科的重要方法。宿主细胞吞噬病原体后其表征将会改变。利用实时PCR仪或者ELISA的技术，测量与基因编码蛋白相关的行为是消除病原体还是免疫逃逸。多数研究都利用主要宿主细胞或者细胞系在体外实现。该方法得到的数据能够说明RNA的表达或细胞培养中回收的蛋白质的量。在实验条件下，所有的宿主细胞拥有相同数量病原体具有合理性。然而，利用吞噬细胞的病原体吸收是不同步的。所以，包含了不同数量病原体的宿主细胞导致不同致病菌诱导的蛋白质生物合成。因此，我们构建了一项技术应用免疫荧光高通量分析方法用来检测与宿主细胞相关的病原体的数量。结合多色分子染色，使分析宿主细胞种群的感染情况和寄生负荷的结果（相关宿主细胞的表型）变成可能。

寄生虫与宿主细胞的联系是微生物学和免疫学其中重要的一部分。随着单克隆抗体和荧光标记试剂应用的产生，关于宿主细胞在进程中的变异研究越来越多。

事实上，科研中已经存在利用多通道流式细胞分析术和荧光显微技术方法来检测寄生虫与宿主细胞关系。以上两种方法都具有优缺点。流式细胞分析术（FACS）能够检测拥有寄生虫的宿主细胞的表型，但是不能精确到单细胞中寄生虫的数量。而且，流式细胞分析需要单细胞制备所以不能做到细胞原位的定位。虽然荧光显微技术的准确性更高，拥有寄生虫的宿主细胞可以说明原位表面marker的表达情况。但是，做到宿主细胞寄生负荷marker强度的高度客观仍然存在困难。因此，一种能够将单细胞定量和宿主细胞表型分析相结合的技术是十分必要的。

实验的分析部分，我们利用了奥地利TissueGnostics公司的TissueQuest和StrataQuest软件，此软件能够同时满足单细胞定量分析和宿主细胞表型分析。以Dot-Finder专利运算法为核心的新型高通量多色显微成像技术，分析感染了L.major的原位及体外巨噬细胞。该方法做到了对拥有病原体的成核细胞的全面分析。与流式细胞术（FACS）相比，荧光标记marker的强度能够在原位单细胞级别定量且不需要制备细胞悬浮液。另外，TissueQuest软件能够实现从实验数据精确反向回溯到影像中的细胞。反向回溯的特征可以用来检测原位细胞亚群，设门细胞的定位信息。同样，此项功能可以作为最终的结果构象。

本实验中应用三种marker：DAPI为核染色marker，AF546（CD11b）和Cy5(F4/80)为另两种。
通过调节如下简单参数完成软件分析：
a. 核的尺寸
b. 面积
c. 灰度值
应用反向回溯特点实时观察创建的阳性细胞散点图。根据细胞尺寸和染色强度确定cut-off值。检测DAPI的阳性值和细胞中活性L.major，利用ring mask功能创建DAPI通道。

淋巴腺体部分的胞内病原体检测

上图中为TissueQuest软件的细胞核检测和ring mask计算功能。灰阶图影像利用StrataQuest软件进行分析。单通道灰阶影像利用TissueQuest软件进行分析。
（A）通过参数调节进行核检测（B）创建ring mask (C)ring mask中黄色高亮
部分为自动筛选ROI中病原体。

TissueFAXSi-plus设备完成了影像的扫描部分

利用此设备做到单通道影像获取，利用四通道进行荧光检测（DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5）。每个影像包含将近50-200个细胞，并且TissueFAXS能做到自动拼接。利用TissueQuest软件的参数进行核检测。每个荧光通道的影像和多个FOV都能够被自动获取，收集和后期的组合。

TissueQuest检测各种ring mask中的L.major病原体

根据活性病原体的微弱DAPI信号和复杂的背景信息，新型的运算法需要从中识别病原体。每种独立的运算法不可能同时满足所有的实验需要。Parasite finder预设程序可根据用户需要选择方法最高程度的区别背景与待分析部分。（A）ring mask圈出胞质部分，代表缺少病原体培养的条件下的巨噬细胞。（B）蓝色部分为感染的巨噬细胞的ring mask,黄色箭头标出DAPI的阳性信号。（C）举例说明的运算法用来检测微弱信号区别没有被感染的巨噬细胞的ring mask中的伪信号。（黄色部分）（D）创建伪阳性信号。多于30个病原体的巨噬细胞被蓝色标出。（E）检测微弱信号区分没有被感染的巨噬细胞的ring mask中的非伪信号。（F）所有被感染的巨噬细胞（黄色部分和黄色箭头）均被识别出。

TissueQuest定量分析感染的巨噬细胞病原体密度和感染比例

（A）软件自动计算感染与未感染的巨噬细胞。（B）每个巨噬细胞胞内寄生虫的平均数量的定量分析。在分析了237个与8639个细胞后，得出随即选择的样本足以证明总感染比例的正确性。（C）胞内寄生虫与巨噬细胞的关系。胞内病原体的数量和Y轴相应的病原体对应的巨噬细胞拥有病原体的数量区间。

此图阐明巨噬细胞中的活病原体的高度混杂性。推测原因为多样化的吞噬作用和病原体繁殖的加强。巨噬细胞的表型决定胞内病原体扩张存在可能性。

利用感染与未感染的原位巨噬细胞定量分析骨髓细胞marker的表达

TissueQuest软件根据胞内病原体，估算每个成核原位宿主细胞。通过拥有不同数量病原体的巨噬细胞，比较不同marker的表达。
拥有不同寄生虫数量的巨噬细胞的表型分析。
(A)直方图表示X轴巨噬细胞拥有病原体与Y轴病原体的数量。TissueQuest软件得到细胞核，ring mask，ring mask中的病原体，ring mask中的CD11b或者F4/80的强度表达（B）拥有不同数量病原体的巨噬细胞的平均强度分析。

体外原位成活与失活胞内病原体的诊断

此图为体外活细胞和死细胞的定量分析。因为失活病原体不能够吸收DAPI，所以软件能够做出宿主细胞中病原体的区别。对样本进行EB-AO平行染色。StrataQuest识别细胞的胞质（绿色部分），细胞与细胞接触部分（橘色）。

（A）AO灰阶图用于薄膜的检测（绿色部分），细胞边缘的确定（橘色部分）。（B）对粘连细胞进行详细分析。（C）反向回溯确定巨噬细胞拥有多于2个失活寄生虫。（E）拥有失活寄生虫的巨噬细胞的频率分析。（F）拥有不同数量失活寄生虫的吞噬细胞的频率分析。

冰冻切片利用DAPI染色然后TissueQuest进行分析。DAPI的信号指出病原体的DNA并未退化。活检，活检，干燥前的病原体仍然具有活性。StrataQuest软件创建胞核（橘色）和核膜（绿色）。因此，DAPI阳性病原能够在宿主细胞的胞浆部分进行识别。

此图为寄生负载的评估。（A）被感染的淋巴腺。灰阶图为DAPI+宿主细胞核和寄生虫DNA。（B）胞核，胞浆和寄生虫的重叠影像（C）（D）反向回溯拥有3和5-10寄生虫的细胞（E）感染细胞的寄生负载。
此实验中，TissueQuest和StrataQuest软件能够检测如下特点：
1) 寄生负担
2) 感染细胞的表型
3) 定位
4) 细胞-细胞联系

后续研究中会着重在宿主-寄生虫的联系的分子反应机理，在微生物方向疾病治愈做出提高。