用LC-TOF和LC-离子阱质谱分析柑橘和橙汁中的采后杀菌剂及其代谢物

摘要

      本应用报告报导了用液相色谱/飞行时间质谱和液相色谱/离子阱质谱技术（LC/TOFMS 和 LC/ITMS），测定橙子及橙汁中两种重要的采后杀菌剂（抑霉唑和噻菌灵）以及抑霉唑的一种代谢产物。包括橙子样品快速制备的详细过程，以及从橙汁中分 离杀菌剂和代谢物的固相萃取方法。通过用 LC/ITMS 对元素组成和碎片的精确质量数进行测定，有助于解析降解途径，对这些杀菌剂和代谢物进行鉴定。本报告还包括对来自市场的橙子和橙汁真实样品的分析结果。

前言

      噻菌灵和抑霉唑广泛应用于橙子的采后处理（图 1），其目的是在以后几天或几周的时间内的运输过程中起到保护水果的作用。杀菌剂只对果皮表面进行处理。在欧洲和美国，水果上市之前需要对抑菌唑和噻菌灵 的最大残留限（MRL）进行监测 [1, 2]。由于这些化合物无所不在，也经常在进口水果中被检测到 [3]。

      因此，要确保食品安全，就必须对许多市场样品进行检测。此外，抑霉唑很容易代谢成 1-（2,4-二氯苯）-2-（1H-咪唑-1-）1-乙醇，有时可以在橙子中检测到[4]。在美国，要求控制抑霉唑及其代谢物的总和，因此，测定母化合 物的方法还应当包括对其代谢产物的测定 [5]。

      有一些文献报道了抑霉唑和噻菌灵的 LC/MS 分析方法，但涉及抑霉唑代谢产物的较少，用 LC/MS 精确质量分析的方法未见报道 [6]。本应用报告介绍了用电喷雾液相色谱/飞行时间质谱和液相色谱/离子阱质谱 (LC/TOFMS 和 LC/ITMS) 快速、同时测定水果
中这两种重要的采后杀菌剂的方法。还可参考较早的一篇关于分析水果和蔬菜中多菌灵和噻菌灵的应用报告 [7]。


实验方法

水果提取：QuEChERS

      QuEChERS（快速、简便、经济、有效、耐用而安全）是从被广泛采用的食品中快速提取杀虫剂的方法。（步骤详见原文）

      进样 50 µL 进行水果和蔬菜提取物的 LC/TOFMS 分析。未富集样品在同一点同时直接进行 LC/TOFMS或 LC/ITMS 分析。

果汁提取

      用固相萃取 (SPE) 从果汁和果汁型汽水中提取采后杀菌剂。选择 Accubond C-18 SPE 柱芯作为填料（部件号 188-1356）。（步骤详见原文）

LC/TOFMS 方法

      仪器 安捷伦 LC/MSD TOF 飞行时间质谱仪

LC/ITMS 方法

      仪器 Agilent LC/MSD 离子阱


结果和讨论

橙子中的抑霉唑

      图 2 显示了对橘皮提取物的色谱分离，有两个大峰，很可能是采后杀菌剂，抑霉唑和噻菌灵。用下列技术对其进行了鉴定。得到了每个峰的精确质谱图，测定了 A+2 同位素峰（图 2 和图 3）。例如，根据质谱图怀疑 17.9 分钟的峰含氯（图 3），验证后其含有两个氯后，用TOF 软件的计算器设定检索标准，只 搜 索 到 了 一 个 结 构 式，再参考Merck 索引给出了抑霉唑唯一的结构式。同样，7.6 分钟的给出了噻菌灵唯一的结构式。下一步是用LC/MS 离子阱检测分子裂解的碎片，以进一步确证结构。

抑霉唑的裂解

      下一步的研究工作是对杀虫剂的特殊碎片离子进行鉴定，以确认抑霉唑的鉴定。用 LC/ITMS 三级 MS 对17.9 分钟大峰的裂解途径进行了测定。通过裂解途径验证 LC/TOFMS 检测得出的抑霉唑结构是否合理。图 5 显示了未知峰裂解离子的结构，所有结构都符合抑霉唑的推论。接下来要用 LC/TOFMS 测定精确质谱图。在此，我们把从 LC/MSD 得到的裂解信息，抑霉唑的建议结构如图 5 所示，和精确质量信息结合起来，对抑霉唑就有了一个完整的匹配鉴定。

      来自两方面的证据（LC/TOFMS 和 LC/ITMS）提供了碎片离子和信息，不需要使用对照品，就将根据母离子结构的裂解确证抑霉唑的鉴定。同样，用离子阱检测噻菌灵，得到 m/z 175 碎片离子，符合噻菌灵的结构。然后，我们在用对照品进行最后的确证。


抑霉唑的代谢物

      在橙子提取物中，我们发现有一个峰（保留时间 14.9分钟，见图 2），与抑霉唑（两个氯原子）的同位素丰度相同。在 Sigma-Aldrich 商业电子目录中检索元素组成，发现了唯一的匹配：1-（2，4-二氯-苯基）-2-咪唑基-乙醇，符合抑霉唑的降解（见图 6 m/z 255 离子）。

      对抑霉唑降解产物所得数据和报告的文献检索与我们的结果一致（抑霉唑代谢物，R14832）[4]。实际上，在美国，控制的是抑霉唑和抑霉唑代谢物的总和，所以也需要对抑霉唑代谢物残留进行检测 [4]。最后，我们用标准对照降解产物进行了确证。


橙汁中抑霉唑的鉴定

      图 7 和图 8 显示了橙汁中 LC/TOFMS 色谱图（见18.0 分钟的色谱峰）和抑霉唑的鉴定（m/z 297.0556）。分析了几个样品，只有这个样品中含抑霉唑。这可能是因为橙汁的制作中通常不会压榨果皮。但是，有些“榨汁机”压榨的是整个橙子，不去 皮。在这个例子中，也存在橙汁中包含杀菌剂的可能性。请注意，不管橙汁提取物的基质和色谱图多么复杂，LC/TOFMS分析都能得到良好的结果。


结论

•    LC/TOFMS 分析是水果和果汁中杀菌剂及其代谢物的有力分析工具，是环境食品化学的新工具
•   标准和碎片离子的元素组成和结构碎片可以用离子阱 MS/MS 确证
•   在抑霉唑这个例子中，使用 LC/TOFMS 和 LC/ITMS，可以不用标样而进行代谢物的鉴定。浓度与对水果和果汁中杀菌剂控制的 EU 指令性标准相当或更低