用GC/MS/MS和反吹技术快速筛选和确认奶粉及大豆中三聚氰胺及其类似物

摘要

      通过利用安捷伦 7890A/7000A 系列带 Ultimate Union 吹扫的三重串联四极杆 GC/MS 联用和反吹技术，开发了一种快速筛选和确认婴儿奶粉和豆制品中的三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的方法。该方法中的提取及衍生过程与 FDA（美国食品和药物管理局）的 GC/MS 方法相同。在 0.16到 2.5 ppm 的浓度范围内可获得卓越的线性度（R2>0.99），且运行时间不到 15 分钟。

前言

      由于在美国生产的奶粉、分布于加拿大市场的巧克力、在荷兰销售的饼干、在泰国销售的炼乳以及在香港销售的鸡蛋中均检测到了三聚氰胺，在食品中搀杂三聚氰胺 已迅速成为一个国际问题。对此，许多国家已经建立了针对三聚氰胺的许可浓度限制，如 FDA要求婴儿奶粉中三聚氰胺的最高残留限量 (MRL) 为百万分之一 (1  ppm)，其他产品则为 2.5  ppm。FDA的 GC-MS 筛选法 [1] 能够检测的三聚氰胺及其类似物 (三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸) 的灵敏度为 2.5 ppm。然而，FDA 在 2009 年 2 月的进口警报要求所采用的测试方法对于三聚氰胺及其类似物的检测灵敏度必须达到 0.25  ppm，以保证检测结果符合 MRL 规定。因此，在新的规定下，FDA 的 GC-MS  筛选法已不能适用于筛选三聚氰胺及其类似物，其确认也需要通过额外的正交法进行。

      本应用中说明的方法对 FDA 的 GC–MS 筛选法进行了改进，采用了新型 Agilent 7000A 系列三重串联四极杆 GC/ MS 联用技术。改进后的新方法不改变样品的提取和衍生程序，通过使用带吹扫接头的气相色谱柱和反吹技术，使得运行时间在 15 分钟以内。该方法可以使三聚氰胺及其类似物的检测精度达到 0.25 ppm，其定量也具有高度的重现性和准确性。最重要的是，这种方法经一次短时间运行就能实现三聚氰胺及其类似物的筛选、定量和确认。


实验

仪器

      实验所采用的仪器包括配置分流/不分流毛细管进样口的安捷伦 7890A 气相色谱仪、配置三重离轴检测器的安捷伦 7000A 系列三重串联四极杆 GC/MS 联用仪以及安捷伦 7683B 全自动液体进样器 (ALS)。分流/不分流进样口装有一个长寿命隔垫 (部件号 5183-4761)和一个去活的分流单锥形注射衬管  (部件号  5181-3316)。用 10 µL 注射器 (部件号 9301-0714) 注射。各仪器使用条件列于表 2。（详见原文）


结果与讨论

带 Ultimate Union 吹扫系统的反吹技术

      反吹技术可以从色谱柱中除去高沸点物质，通过将后流出的组分从进样口的分流放空口中反吹出去，而使高沸点组分不经过整个色谱柱，也不进入 MSD。反吹可以降低化学噪音和分析周期时间，从而提高检测效率。由于减少色谱柱和质谱检测器的维护时间，系统的正常运行时间也有所增加。安捷伦微板流路 控制技术模块包括一个专有的解决方案，能够快速简便地实现反吹，死体积小，从而提高分离度。该模块还包含垫圈和接头以消除漏气。所有微板流路控制技术模块 都需要使用辅助电子气动控制 (EPC) 模块或气动控制模块 (PCM) 来提供精确控制的第二气源，以引导色谱柱气流能流向正确的色谱柱或检测器。在正常操作时，PCM  的压力等于或略高于通过色谱柱的载气压力。在反吹过程中，进口压力下降到 1 psi，而 PCM压力增加，从而驱使色谱柱气流反向流经色谱柱，并吹扫出进样口。

      一个替代反吹的独特方法是在分析柱的中部使用微板流路控制技术装置。此时，采用两个 15 米色谱柱替代  30  米色谱柱，两个色谱柱由超低死体积吹扫Ultimate Union 连接（如图 1 所示），PCM 则只提供足够的补充气与从第一个色谱柱中的气体流量相匹配。由于只有最优的载气流量进入质谱仪，因此需要增加的气流很小，不会发生灵敏度降低。该配置的反 吹过程，是通过降低第一个色谱柱的流量和压力，增加第二个色谱柱的流量和压力来完成的。

      图 2 给出了具有吹扫终端配置的反吹的例子。图中上端的图谱显示了六个标样，其中第三个峰被认为是最后一个感兴趣的峰，第四个峰是第一个高沸点组分干扰物。中图 显示了 (a) 相同标样在 10.1 分钟开始反吹，其中流量在第一个 15 米色谱柱中下降，(b) 在第二个色谱柱上升。a 和 b 点之间的时间是最后要分析的组分在第二个色谱柱中的停留时间。最后的组分被保留，但后洗脱物不会进入到质谱检测器中。下图说明在接下来的空白运行中没有交 叉污染。或者，可以在最后一个感兴趣的峰被流出（b  点）后开始反吹。这就避免了需要通过实验来确定最后流出的目标化合物在第二色谱柱中的停留时间，从而缩短运行时间周期。


三聚氰胺及其类似物的分析

      基于三重串联四极杆 GC/MS  联用系统，我们开发了一种一次运行就能出色的分离和分析三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的新方法，且运行时间不到 15  分钟 (图 3)。新的三重串联四极杆GC/MS 法显著提高了检测灵敏度和选择性，图 4  给出了其与 GC/MS 选择离子检测 (SIM) 的对比。新方法能够在 0.25 ppm 灵敏度下对三聚氰胺进行非常干净地定量 MRM 分析，而不管采用何种 SIM 离子，GC/MS SIM 法都难以在 2.5 ppm 灵敏度下有效地减少化学噪音。

灵敏度与定量

      在基质（包括婴儿奶粉和豆粉）中分别加入三聚氰胺及其三种类似物的标准品，浓度分别为 0.78 、1.25、3.9 和 12.5 ng/mL，对应于 0.16 到 2.5 ppm 的检测确认水平。并针对每种基质中的四种化合物建立校准曲线。图 5 和图 6 表明，三聚氰胺及其三个类似物的曲线均显示出了极好的线性，R2 的值非常接近 1.00。表 4 和表 5 表明，对两种基质中四种化合物的定量准确性也非常高。（图详见原文）

确认

      为了确定一套可广泛接受的程序来对限定物质进行科学确认，欧盟科学家开发了“识别点”系统。分析方法提供的识别点越多，越能肯定所确认的化合物的存在。确 定化合物的 MRL  要求有三个识别点。当由于化合物的毒性而无法界定其 MRL  时，则该化合物在所有级别上都是被禁止的。这些化合物要求有四个识别点。当 GC/MS  需要监测四个离子以提供四个识别点时，使用三重串联四极杆的 GC/MS/MS  联用仪则只需监测两个选择反应监测 (SRM) 通道。利用三重串联四极杆 GC/MS  系统分析三聚氰胺及其类似物需要利用至少两个 SRM  通道，可以在单次运行中获得有效筛选和完全确认。

      图 7 和图 8 显示了婴儿奶粉和豆粉中的四种化合物GC  分离的定量和定性离子通道的色谱图。每一种情况定性离子都对定量离子进行了归一化处理，以便从两个离子的轮廓图中能更好的显示出一致的峰形。因此，这些离 子轮廓图为每个样品基质中的四种化合物都给出了完全的确认。（图详见原文）


结论

      为了在一次短时间运行中就实现对三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的筛选、定量和确认，通过应用安捷伦科技公司的三重串联四极杆GC/ MS 联用系统，对 FDA 的 GC/MS 筛选方法进行了改进。该方法不改变原有的提取或衍生程序，且其运行周期时间仅约为 15 分钟。此外，该方法符合新的FDA  测试要求，即测试灵敏度应达到 0.25  ppm，并且在 2.5  ppm  的浓度范围内表现出了优异的定量线性，定量精度达到 97% 以上。为了对阳性确认提供有效的识别点，分别给出了四种化合物的两个 SRM 通道。