用 1.8 µm 反相 (RP) 色谱柱进行快速氨基酸分析 (AAA)
摘要
氨基酸分析 (AAA) 常被用作蛋白质组学和食品质量检测中测定样品中氨基酸 (AA) 准确组成的工具。为了及时分析样品，需要分析周期短；为了测定有限量的样品需要高灵敏度的方法；为了提高实验室效率，需要自动化的方法。本文报道了用新开发的 1.8 µm 粒径色谱柱测定氨基酸的新方法。这种专利的填料经过专门设计，其产生的反压比市场上任何其它亚 2 微米填料都小，可以在 400 bar HPLC 系统以及耐压更高的仪器上使用。我们采用惠普/安捷伦公司 1988 年首次推出的 OPA/ FMOC 化学衍生法，并改善了以前方法的精密度、分析时间、柱寿命和耐用性 [1-4]。
引言
氨基酸的检测和定量分析一直是蛋白质和食品分析的重要部分，1951 年 Moore 和 Stein 研制出了第一台氨基酸分析仪，将未衍生的氨基酸 (AAs) 用离子交换色谱分离后，用茚三酮进行柱后衍生，在可见区检测[5]。1958 年由 Beckman 开发并推出了全自动分析仪。它成为蛋白质分析的里程碑，并在 1972 年诺贝尔化学奖核糖核酸酶的研究中发挥了重要作用。以前需要几周完成的分析，用该方法不到 1 天就可以完成。Beckman 新一代的氨基酸分析仪已将分析时间缩短到大约 110 分钟，但用茚三酮灵敏度仍然有问题。
用邻苯二甲醛 (OPA) 和巯基乙醇进行柱后衍生反应有一些可能，但却只能检测一级氨基酸（见图 1a）。1971 年首次报道了用 OPA 对氨基酸进行柱前衍生[6]。衍生物相当不稳定，但这一过程可以实现自动化。灵敏度得到了提高，特别是使用荧光检测 (FLD)时。OPA 不发荧光，其衍生物有很强的荧光，但二级氨基酸仍不能检测。另一种衍生化试剂氯甲酸 9-芴基甲酯 (FMOC) 和一级、二级氨基酸都能反应生成稳定的衍生物，但其本身却具有很强的 UV 吸收和荧光（见图 1b）[7]。衍生反应结束后还需要进行提取或与疏水性很强的胺进行反应，以除去过量的 FMOC 和反应副产物 [8]。这种方法也可以作为自动化柱前衍生方法 [9]，但商品化时存在问题，与没有使用反提取的系统相比，相对标准偏差 (RSD) 较高。
1986 年惠普/安捷伦将这两种化学反应依次结合，不用反提取实现了蛋白质水解液氨基酸的全自动衍生、色谱分离、检测和报告 [1]。1988 年开发并销售了商品化的分析仪，总分析时间只有 36 分钟，灵敏度达到飞摩尔水平。这对于生物技术公司和大学的研究人员来说，无疑是迈向正确方向的一步，因为他们的样品非常有限，尤其是在药物研发的早期阶段。
为了使其在商业上可行，需要进行一些化学上的改进：将硫醇换成 3-巯基丙酸 (MPA) 使 OPA 衍生物更稳定；所有一级氨基酸先与 OPA 反应，将一级氨基酸从下一步的反应中定量除去；然后加入 FMOC，FMOC 只与二级氨基酸反应。由于 FMOC、FMOC 衍生物和反应副产物比任何 OPA 衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何一级氨基酸的检测。因为只有几种FMOC 衍生物，所以可以使用简单的两段梯度将这些氨基酸与反应副产物和FMOC 分离 [1]。详见图 1 和图 2。相应于各个色谱峰的化合物名称见表 1。
实验部分
仪器
本文中的结果都是在 Agilent 1200SL HPLC 系统上测定得到的，该系统包含以下组件：
G1312B，SL 型二元泵
G1379B，微量脱气机
G1367C，高性能多孔板自动进样器 (WPS)，配置
54 x 2 mL（前面）和 15 x 6 mL 样品盘（后面）
G1316B，SL 型柱温箱 (TCC)，安装低扩散组件
G1315C，SL 型二极管阵列检测器 (DAD)，配置半微量流通池
G1321A，荧光检测器 (FLD)
仪器上的所有管线内径均为 0.12 mm（0.005 英寸）。
其它详见原文
结果与讨论（详见原文）
分离条件的选择
重复性和线性
扩展氨基酸 (EAA) 和内标 (IS)
实际样品
图 8 显示了各种窖装啤酒的比较结果。
结论
本工作对氨基酸分析方法进行了各方面的改进。使用1.8-µm 粒径色谱柱可使分析周期缩短一半，从 35 分钟左右缩短到 13.5 分钟左右。最早洗脱的天门冬氨酸和谷氨酸的峰形都得到了改善。提高了二级氨基酸，以及反应最慢的氨基酸，如赖氨酸的重复性。线性良好（r 2 接近 1），平均峰面积重复性低于 2%。报道了各种内径（从 2.1 到 4.6 mm）的新快速分离高通量Eclipse Plus C18，1.8-µm 柱的使用。新的流动相和进样器条件非常简单，只要简单地改变流速就可以在2.1-到 3.0-或 4.6-mm 内径柱之间进行转换。也可以使用快速分离高通量 Eclipse Plus C8 或快速分离高通量 Eclipse XDB-C18 或-C8 柱（数据未显示）。
