不同溶剂对蜂胶黄酮提取率影响的研究

【关键词】  溶剂

摘要：目的检测泰山蜂胶提取液中总黄酮含量。方法用不同浓度乙醇做溶剂，采用超声波法提取泰山蜂胶，利用紫外分光光度法对泰山蜂胶提取液中总黄酮含量进行定量分析同时用原子吸收-分光光度法检测了提取液中铅含量。结果不同浓度乙醇的蜂胶提取率和黄酮含量不同，且铅含量均小于1 μg・g-1。结论泰山蜂胶的黄酮含量较高，具有较高的药用价值。

关键词：泰山蜂胶；提取液；总黄酮；定量分析

蜂胶是蜜蜂采集松树、杨树等植物的芽苞分泌物、树脂等，并混入蜂蜡和其上颚腺分泌物经咀嚼加工而成的一种具有芳香味的胶状物。蜂胶富含多种营养成分和多种具有药用价值的活性成分，这些活性成分中主要是黄酮类化合物。黄酮具有抗菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤、免疫调节、清除自由基等重要药理价值［1，2］。蜂胶易溶于有机溶剂，故常用醇提法提取。本实验室对泰山蜂胶进行提取，并检测了提取液中黄酮及铅的含量。

1 材料与方法

1.1   材料

1.1.1 原料及来源泰山柏树蜂胶取自泰山之虎山养蜂场；蜂种:意大利蜜蜂，采集时间：秋季。

1.1.2 实验器材S-54紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司)；M-3100型原子吸收-分光光度计(美国PE公司)；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； KS-500电子天平；FC204电子分析天平(上海恒华科技有限公司)。

1.1.3 试剂芦丁(国药集团化学试剂有限公司)；三氯化铝(天津市博迪化工有限公司);硝酸（HNO3）、甲醇（methanol）为分析纯；高氯酸（HCLO4）为优级纯；乙醇(alcohol)浓度95%;水为三蒸水。

1.2 方法

1.2.1 蜂胶提取方法采集的新鲜粗蜂胶置-20℃过夜后粉碎，分别用三蒸水、浓度为24%，30%，70%的乙醇与蜂胶按固液比1∶4的比例浸泡1 h,于超声波清洗器中超声20 min，静置2 h，再超声20 min，静置2 h后，过滤至上清液澄清，倒入棕色瓶中低温保存备用。四种浓度乙醇提取液以下依次简称为water，24%al，30%al，70%al。每组分别重复提取3次，分别测定结果取其均值。

1.2.2 蜂胶提取率测定四种提取液各取10 ml，分别加入四个已经准确称重的干燥空烧杯中，在恒温电热套中加热，待干燥后称重，减去空烧杯的重量，即为提取液中蜂胶得率。见表1。表1 四种不同浓度乙醇蜂胶提取率（略）

1.2.3 四种蜂胶提取液中总黄酮含量测定按芦丁标准品法［3］。仪器使用S-54紫外分光光度计。测定波长420 nm。

标准曲线的绘制：精确称取芦丁50 mg加15 ml甲醇溶解，转移至50 ml的容量瓶中定容，该标准贮备液浓度为1 mg／m1AlCl3显色分别配制浓度为0.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 μg/ml系列溶液，从图1可看出在芦丁的最大吸收波长420 nm处测定吸光度最稳定。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,计算机自动绘制工作曲线见图2，并确定浓度方程为：C=38.739A+0.329，相关系数r＝0.996 7。

样品测定：分别移取蜂胶提取液各200 μl，70%乙醇提取液取10 μl，各加0.5 ml 2.5%的AlCl3和0.8 ml 1% KCl，用乙醇定容至5.00 ml，摇匀后静止30 min后进行测定，直接读取浓度并根据下列公式求算出原液的含量。见表2。表2 四种不同浓度乙醇蜂胶提取液中总黄酮含量（略）

1.2.4  蜂胶提取液中重金属铅含量测定将四种提取液分别在恒温电热套中加热，待干燥后称取200 mg加入混合酸10 ml（HNO3与HClO4 3∶1混和），低温消化至澄清无色液体，水浴加热驱酸，近干，加少量亚沸纯蒸水定容上机检测。结果见表3。表3 四种不同浓度乙醇蜂胶提取液中铅含量（略）

2  结果

表1结果显示，70%乙醇提取蜂胶得率最高，且有随乙醇浓度降低提取率减少的趋势。从表2可见,70%乙醇蜂胶提取液中黄酮含量明显高于其他组,且四组提取液中黄酮含量与蜂胶得率成正比。

从表3可看出，四组提取液中铅含量均小于1 μg・g-1。

3 讨论

蜂胶具有多种生物学效应和药理作用，是一种具有广泛开发前景的药物。对肿瘤的预防和治疗作用已得到肯定［4］。对支气管哮喘、咽喉炎有预防治疗作用对幽门螺旋杆菌的抑制作用也得到证实［5，6］。蜂胶的化学成分非常复杂，由于受生态环境和气候条件的影响，植物渗出物和分泌物的不同造成不同地区采集的蜂胶化学成分又相差很大，生物学活性也因此有所变化，因此应尽可能多的提取出有效成分，而剔除其杂质，方便更好地利用。蜂胶可以有效地溶于有机溶剂，如:甲醇、乙醚、乙醇、丙酮、醋酸乙酯等。但乙醚毒性大易挥发，丙酮易挥发刺激性大价格较贵，而正丁醇则价格较贵且难以从提取物中去除，醋酸乙酯具有刺激性气味，这些都使得它们不适宜用作提取蜂胶的提取溶剂，而乙醇作为一种溶剂具有无毒性、无不良气味、价格便宜、来源广和提取完成后可以从提取物中除净及乙醇回收率高等优点，因而本实验选取乙醇作为提取溶剂。其它如国内外用于药品和食品的蜂胶,大部分采用乙醇作提取溶剂。当然在最近研究出的用超临界CO2流体萃取蜂胶的方法有许多优越性,但在实际工作中由于它的工艺较复杂，成本太高，还不适于生产应用。因此，用乙醇提取在目前仍是一种方便安全且经济有效的方法。

本实验室采用超声波法配合提取蜂胶，两次超声20 min后70%的乙醇对泰山蜂胶提取率和提取液中黄酮含量(分别为40.73%和28.62%)，优于一次超声20 min所得贵州蜂胶与黄酮含量(分别为20.69%和16.54%)［7］。曾有报道［8］，水在4℃浸泡北京产蜂胶5 d所得黄酮量为0.41%;用蒸馏水浸提杭州产蜂胶9 d所得黄酮含量为0.80%［9］。而本实验室利用超声波提取泰山蜂胶，水提取液中黄酮含量为3.35%，明显高于浸泡法。杭州蜂胶25%的乙醇浸泡5 d黄酮提取率为1.11%，泰山蜂胶24%的乙醇超声波提取黄酮得率为7.28%。不同产地的蜂胶由于地理环境和气候及采集的季节不同，其活性成分含量也会有很大差异。分析泰山蜂胶黄酮提取率高的原因，第一，泰山蜂胶是采集于秋季，主要植物来源是泰山松树的树皮、枝叶、果实，而松科中的黄酮类化合物成分以游离态或苷的形式存在，相对于其他形式的黄酮类易提取。第二，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，以加速药物有效成分进入溶剂。

蜂胶原料中除有效成分以外，还有很多需要分离除掉的杂质，尤其是含量很高的重金属铅，必须将其分离除掉后才能食用。它在人体内具有蓄积性，不易排出体外，对各组织都有毒性作用。我国食品卫生法规定，大多数食品中铅的含量不得超过1 mg/kg。然而由于环境污染造成树胶中含有一定量的铅，所以蜜蜂采集树脂后“加工”形成的原蜂胶中也不可避免地含有铅。一般来说，每一千克蜂胶原料中铅的含量可达几十毫克，而且从蜂箱中不同部位取出的蜂胶原料其含铅量也有差别，最高的能达到几百毫克，所以，应经过处理以剔除蜂胶中的铅。我们采用的四种浓度乙醇提取蜂胶液中铅含量均小于0.5 μg・g-1。如表3所示，均远远低于国家标准。且我们采用超声波法提取蜂胶，减少有机溶剂的挥发，从而提高提取率，缩短提取时间，并且避免高温对蜂胶有效成分的影响。所以此种方法提取蜂胶既安全又有效。

参考文献：

［1］Burdock G A. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis(propolis). Food Chem Toxicol,1998,36:347.

［2］Marcucci M C. Propolis:chemical composition,biological properties and the rapeutical activity［J］.Apidologie,1995,26:83.

［3］毛丽珍,徐世芳.蜂胶口服液中黄酮类化合物的测定［J］.中草药, 1998,29(4):231.

［4］Orsolic N, Sver L, Terzic S,et al. Inhibitory effect of water-soluble derivative of propolis and its polyphenolic compounds on tumor growth and metastasizing ability: a possible mode of antitumor action［J］.Nutr Cancer.2003，47(2):156.

［5］Khayyal MT,el-Ghazaly MA,el-Khatib AS,A clinical pharmacological study of the potential beneficial effects of a propolis food product as an adjuvant in asthmatic patients.Fundam Clin Pharmacol［J］.2003 Feb;17(1):93.

［6］Banskota AH, Tezuka Y,Adnyana IK.Hepatoprotective and anti- Helicobacter pylori activities of constituents from Brazilian propolis. Phytomedicine［J］.2001 Jan;8(1):16.

［7］牟兰,曾唏,王海燕.荧光光度法测定蜂胶中黄酮［J］.光谱实验室，2001,18(2):252.

［8］何好,赵静.加工工艺对蜂胶黄酮提取量影响的初步研究［J］.中国养蜂，2001,52(6):29.

［9］韩文辉,钟立人,张燕平.蜂胶有效成分提取研究［J］.黑龙江商学院学报・自然科学版，2000,16(4):18.

基金项目：山东省教育厅资助课题(No.JOOK62)

作者简介：张云香(1971)，女(汉族)，山东潍坊人，现在读泰山医学院2003级硕士研究生，学士学位，主要从事动脉粥样硬化的发病机理-蜂胶对血管内皮细胞的保护作用机理研究工作.

通讯作者简介：王家富(1951)，男(汉族)，山东枣庄人，现任泰山医学院病理生理学教授，主要从事动脉粥样硬化的发病机理研究工作.