临床质谱应用：核酸质谱检测循环肿瘤DNA
发布: 2015-05-15 23:23:32来源: 北京毅新博创生物科技有限公司
从2005年开始，每年年初由Journalof Clinical Oncology出版的美国临床肿瘤协会年度报告都几乎是国际范围内对当年癌症研究的最新指导。今年年初的《Clinical Cancer Advance 2015》更是对过去十年间世界范围内针对癌症的各种治疗与进展进行了综述。在该报告中，液体活检（liquid biopsies）技术被列为今后十年内可广泛应用的一项癌症检测技术1。
与常规的触诊、影像学、生化检测、免疫检测等不同，液体活检技术的检测对象主要是循环肿瘤细胞（cycling tumor cells， CTC）和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）。除了采用常规流式细胞术和磁珠吸附等对循环肿瘤细胞进行测定的方法。液体活检的最引人入胜之处在于其可将检测对象扩展至循环肿瘤DNA（ctDNA, circulating tumor DNA），并可用于患者全病程的治疗效果实时监测。测定血液中ctDNA水平不仅仅可快速获知癌症的恶性程度以及患者的生存几率，对治疗过程中ctDNA突变的实时监测还可反映出肿瘤的退变情况并选择更加适合的治疗方案2,3。
那么，如何才能够快速、准确地对ctDNA进行检测呢？对于DNA的检测，当然首推测序技术，无论是成就了人类基因组计划的双脱氧法一代测序技术，还是现在方兴未艾的二代测序技术，以及如雨后春笋般遍地开花的三代测序技术，他们的测试对象都是DNA。但考虑到ctDNA的片段长度大小一般都介于160-500bp范围内，而且含量极低，因此要采用高通量的测序技术来对如此低丰度的待测产物进行研究，也许并不一定是最佳的选择。而通过将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同离子拥有不同的质荷比(m/z)，来对待测样本进行分离和检测的质谱（Massspectromy）技术，则在这一领域具有广泛的优势。
质谱仪，根据其部件功能通常可分为5个部分，①进样系统，②离子源，③质量分析器，④检测器和⑤数据处理系统。对以核酸、蛋白为待测产物的质谱仪而言，其离子源一般需要采用较为温和的电离方式，比如电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI），基质辅助激光解吸电离（Mass-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）等类型。
2002年诺贝尔物理学奖获得者、日本岛津公司蓝领技术员田中耕一正是将质谱技术应用于生物大分子检测的先行者，通过对离子飞行时间（Time of Flight）的判断，准确地得出其分子量，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry）成为了近年来的一种新型的软电离质谱，其已被广泛地应用于生物大分子，在临床检测领域也开始崭露头角。
采用MALDI TOF质谱对ctDNA进行检测的最大优势在于准确度高、重复性好、稳定性强、检测速度快、样本处理标准化。其可用于ctDNA的基因型分析（genotyping），基因突变检测（mutation detection），DNA甲基化（DNA methylation），基因表达（gene expression），拷贝数差异（copy number variation，CNV），单倍体序列差异（haploid sequence variation，HSV）等多项检测与分析。
所述检测已在美国麻省大学伍斯特分子诊断实验室（University of Massachusetts,Worcester Molecular Diagnostics Laboratory），梅奥医学中心（MayoClinic CLIA Lab）等世界知名科研机构与临床医院得到广泛认可与应用，并获得美国FDA批准用于临床检测。
值得注意的是，在这一领域，我们并不落后与国际最新水平。2014年6月，CFDA批准了我国首台用于临床检测的飞行时间质谱系统Clin-TOF I（京食药监械(准)字2014第2400606号）。由北京毅新博创生物科技有限公司生产的该设备同样能够完成上述的各项检测。
为获得精准的数据，毅新公司也与解放军总医院，中南大学湘雅医院临检所，中山大学肿瘤医院等多所国内知名临床机构建立了良好的合作研究关系，对大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、胃癌、食道癌、肝癌和头颈癌等多种癌症的ctDNA进行检测与表征，力争为国人提供最佳的癌症筛选解决方案。
下面以肺癌为例，对Clin-TOF I测定ctDNA的操作流程进行简述，以供读者参考。
1. 样本采集：采集患者的外周血，分离血浆
2. 样本处理：按照毅新博创提供的配套飞行时间质谱系统核酸样本预处理试剂盒（京经械备20140017）以及核酸提取试剂（京经械备20140003），ctDNA基因扩增试剂盒标准程序进行核酸提取，扩增以及片段化
3. 质谱检测：将片段化核酸点靶，即将微量液体布点于Clin TOF I飞行质谱仪的靶上，运行质谱检测
4. 结果分析：收集数据，分析，出具检测报告
对某肺癌患者（II级）术前术后进行的ctDNA检测（KRAS G12V）结果如下：
如上图所示，可清楚得看到术后在5800附件的峰值明显降低，说明术后ctDNA的含量也有所降低，但未完全消失，提示还需进一步观察与监测。
循环肿瘤DNA检测，具有特异性强、实时、无创等特点，可应用于肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发等临床应用领域。可检测的ctDNA序列包括EGFR（无义突变），EGFR外显子19，20，BRAF，KRAS，NRAS等多个基因的200多个突变位点。
此外， 还可对诸如厄洛替尼（Erlotinib） ，达沙替尼（ Dasatinib ） ，西妥昔单抗（ Cetuximab） ，克唑替尼（ Crizotinib） ，依维莫司（ Everolimus） ，拉帕替尼（ Lapatinib ） ，尼洛替尼（ Nilotinib ） ，帕唑帕尼（ Pazopanib ） ，坦西莫司（ Temsirolimus ） ，舒尼替尼（ Sunitinib） ，凡德他尼（ Vandetinib ） ， 威罗菲尼（Vemurafenib）等多种药物的治疗效果进行监测。
应用Clin-TOF I飞行质谱系统，毅新还能够进行药物代谢相关基因的检测。为华法林等药物的使用监测提供更快捷、更准确的治疗用药方案。
参考文献
1.Clinical Cancer Advances 2015: Annual Report on Progress Against Cancer Fromthe American Society of Clinical Oncology. Journal of Clinical Oncology.2015(33):786-809.
2.Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews ClinicalOncology. 2013(10):472-484.
3.An interview with Bert Vogelstein and Kenneth Kinzler. Clinical Chemistry2015(61):9-20.
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