CESI 8000 -Thermo Q-Exactive系统对生物制品第三水平的快速表征
发布: 2018-02-10 23:50:48来源: SCIEX
CESI 8000 -Thermo Q-Exactive系统对生物制品第三水平的快速表征
在生物制药行业，由于单克隆抗体药物（mAbs）的杂质和异质性可以影响安全性或疗效，对其进行全面和可重复性的表征至关重要。单克隆抗体是一类高分子量的糖蛋白（约150 kDa），同时包含一些其他的翻译后修饰（PTMs）。单克隆抗体肽谱（第三水平表征）可以提供关于纯度和异质性的定性和定量的信息。毛细管电泳结合质谱具有优越的分离效率和对于单克隆抗体肽段和糖肽的表征能力。运用电喷雾（ESI）作为电离源，将CE和ESI整合在一个动态的过中（CESI技术），可对多肽和单抗进行高效的分析。
本文中，我们将展示使用CESI 8000（AB Sciex Separation）结合Q-Exactive质谱（Thermo）系统的对曲妥珠单抗的第三水平的表征数据。该分析是将CE与ESI整合在一个动态的过程中，与高分辨质谱结合使用，结果显示该联用有如下优势。不同大小的肽段（3-65氨基酸）都可以被定性、分离和定量。特别是，我们可以对仅仅100 fmol（15 ng）的样品进行降解热点的定性定量分析，如天冬酰胺脱酰胺化、蛋氨酸氧化、谷氨酸环化和C末端赖氨酸的异质性。通过对糖肽的分离、定性和定量可以全面表征Asn300的糖基化热点。总体来说，这些结果表明使用CESI技术结合高分辨率的质谱可以仅需很少的进样量并只使用单一蛋白酶——胰蛋白酶，通过对肽段及糖肽谱图分析，就具有对单抗快速全面表征的能力。
CESI技术对于质谱分析的优势
• 低流速，CESI技术使用的流速大约在20 nL/min，能最大化离子化效率，且大大降低离子抑制效应，从而保证修饰肽段和糖肽更好的离子化。CESI技术使用的是一根开管的毛细管，因而无需其它的毛细管和泵连接流控装置。
• 高效的分离，毛细管电泳的固有高分离效率以及尖锐的峰型可保证高灵敏度和可重复性的定性定量分析。
• 低样品用量，CESI技术需要极少的进样体积（<250 nL）和样品量（<25 ng）。
• 样品残留，使用开管模式且没有任何固体填充，所有样品（包括亲水性和疏水性）都会从毛细管中流出，可以覆盖到单抗的全部序列并且没有任何样品损失和样品残留。
• 全面，CESI技术在单次运行中使用单一的蛋白酶——胰蛋白酶，可实现100%蛋白序列覆盖率并可同时完成单抗纯度、稳定性和糖基异质性的定性定量分析。
• 重现性，在三针重复进样，每针45分钟的分离中，迁移时间相差小于30秒（<1.5% RSD），修饰和未修饰的肽段相对含量测定变化小于2%。
• 正交，CESI技术使用和LC-MS方法正交的分离机制分离、鉴定、定量和验证序列变异以及得到翻译后修饰信息。
实验设计样品制备：从10 mg/mL 样品溶液中取出100 μg 样品，用Rapigest稀释变性，使用DTT还原和IAM烷基化，样品在37 ℃经过胰蛋白酶酶解过夜，干燥，用前导电解质溶液（200 mM醋酸铵，pH=4）稀释三倍，得到最终浓度为300 ng/μL的抗体酶解产物。
CESI-MS/MS：AB Sciex 的CESI 8000连接 Thermo的Q-Exactive质谱仪。
向熔融石英毛细管中进样50 nL溶于约100 mM前导电解质中的样品（相当于100 fmol或15 ng的单抗酶解产物），并在瞬时等速电泳下进行分离前的浓缩。以10%的醋酸作为背景电解质，进口端缓冲瓶和CESI喷口间的分离电压为20 kV。样品重复进样三次进行分析。
质谱的数据采集采用的是数据相关采集（DDA）方式，一级质谱的分辨率为70K，二级质谱的分辨率为17.5K。DDA的参数如下：
一级质谱最大采集时间为120 msec，扫描范围为150-1800 m/z，二级质谱扫描强度大于3.3×104的前10种离子，最大采集时间为60 msec。HCD裂解使用27%的碰撞能量。质谱扫描周期小于/等于1秒。为匹配CESI的尖峰（约30s宽），动态排除时间设为15秒。
数据分析：数据分析运用AB SCIEX ProteinPilot™（肽段和修饰后肽段鉴定），ProteinMetrics Byonic（糖肽鉴定）和Thermo Xcalibur（肽段定量）。通过ProteoWizard MS将Thermo的.RAW文件转换成.MGF文件。使用曲妥珠单抗、常见杂质、以及蛋白的逆序数据库检索。手动提取糖肽并通过MS/MS图谱进行糖类离子的确认。
CESI技术过程
使用瞬时等速电泳-毛细管区带电泳来分离蛋白药物的酶解产物。在区带电泳中，肽段根据它们的电荷/阻力系数，（即电荷/质量比）进行分离。因此根据肽段与其PTM产物的电荷或质量不同而得以分离。在毛细管区带电泳中，向毛细管入口端通过压力进样约10%毛细管体积的样品，使样品在瞬时等速电泳（t-ITP）过程中根据在电场中的迁移率和梯度区域进行聚集。由于进样量提高了10倍，使用t-ITP可将常规CZE方法的灵敏度提高十倍，而并不会损失CZE的高分离效率。
电渗流是在电场中由毛细管内壁产生的电荷引起的。即使在pH为4的10%醋酸缓冲液中，也能使毛细管内壁的硅羟基保持大量负电荷，用以驱动电渗流到毛细管出口。与压力驱动产生的抛物线流型不同，电渗流产生的是塞面流型，可以减少样品带变宽而获得尖锐的峰型。电渗流以20 nL/min的速度驱动所有被分离的肽段到达电离源，之后被电离。在这个速度下，纳喷源的优势得以充分体现。
电喷雾离子化的电压施加在CESI的喷口，以10%的醋酸作为电导液。去除毛细管喷口的聚酰亚胺涂层并且通过化学腐蚀使小离子可以通过毛细管壁，形成毛细管电泳的电流回路。ESI源的作用是使肽段从液态形式转化成气态形式。只有CESI中的流出物进入ESI源，而无任何鞘液的稀释，保证了超低流速nL/min带来超高的灵敏度。
CESI-MS技术肽段的分析
胰蛋白酶酶解肽段具有较大的质量范围和电离状态，适合用CE进行分离。使用CESI技术，曲妥珠单抗酶解的肽段在25-38分钟内得以分离（如图1）。在42分钟后，还可以鉴定出基峰的电泳图(BPE)中没有看到肽段，如糖肽。后续将进行详细讲解。三针的重复性实验中，谱图的定性比较（图1A）和迁移时间（表1）均获得很好的重现性。通常情况下，肽段在质谱中的m/z和CE中的电荷/质量比会存在一定的相关性（图2B）。然而在整个迁移窗口范围内对不同质/荷比的肽段的分离有助于对其进行全面的定性和定量。图1C中一些代表性肽段的分离峰表明了过大和过小的肽段可同时被分离。此外，从这些提取的肽段中可以发现CE分离得到的峰型十分尖锐（15-50秒宽），有利于肽段的定性和定量。
图1. CESI技术对肽段分离。（A）曲妥珠单抗胰蛋白酶酶解产物的三次CESI-MS技术（Thermo QE）分析电泳图。（B）肽图。（C）单次CESI- MS技术运行中具有代表性的大小肽段的提取离子电泳图。
100%的序列覆盖度
在自下而上（bottom-up）的蛋白质组学研究中，有许多因素可以有助于实现100%的蛋白序列覆盖。除了已经阐述过的肽段可以被CESI-MS技术更有效地分离及离子化，蛋白质数据库搜索也是一个很重要的步骤。ProteinPilot™的Paragon计算方法可以快速、方便地对蛋白及超过300种PTMs进行定性，使其成为蛋白酶解产物全面表征的重要工具。如图2显示了在三次重复运行中，数据库搜索结果均获得了重链和轻链的100%序列覆盖度。胰蛋白酶酶解产物的混合物中很小或很大、亲水或疏水的肽段都可以得以分离，使轻链和重链实现100%序列覆盖度。
图2. 经CESI 8000 – Q-Exactive MS系统分离检测，Protein Pilot™数据库搜索而获得的曲妥珠单抗重链和轻链的100%的序列覆盖率。
厂家名称
TripleTOF™ 5600 ：具备三重四极杆性能的高分辨质谱 QTRAP™质谱：定性定量，完美结合 SCIEX是生命科学分析技术研发的全球领先者，帮助科学家们应对复杂的科学挑战。公司研发科学仪器、软件和服务，...
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