单细胞（BD Rhapsody）分选系统操作质控流程

在高通量测序领域，流传着一句话，叫做“Junk in, junk out.”，这就意味着要一个好的数据分析结果，就需要对前期的操作都进行严格的把关，包括样本的制备、测序以及数据的前期处理等。

在整个单细胞测序实验过程中，前期样本的选取以及单细胞悬液的制备是整个实验成败的第一步。当获得单细胞悬液之后，如何精准的判断细胞的质量、监控单个细胞的分选效果则显得更为重要，因为这一步直接关系着最后测序数据的质量以及数据分析结果的好坏。因此就需要对整个实验流程进行严格的质控和记录。

NovelBio使用的单细胞分选系统（BD Rhapsody）可以对实验过程中从单细胞悬液质量评估到Single Cell分选标记的每一个步骤进行质控及记录，包括单细胞悬液中细胞数量、活性的检测，单细胞分选标记过程中细胞、磁珠的铺板情况、细胞被磁珠捕获标记的情况以及双细胞的比例等，在获取实验过程中关键信息的同时，也有效保证了实验结果的可靠性。

图1 BD Rhapsody单细胞分选系统

单细胞悬液质量评估

细胞数量、细胞活性的精准判断对Single Cell分选标记、建库、下机数据的质量都具有着决定性的作用。如若细胞计数偏高，将会影响建库的成功率；计数偏低，则会显著提高双细胞的比例；而细胞活率过低，就会使测序数据的利用率大打折扣，因此把好单细胞悬液质量这一关尤为重要。

BD Rhapsody单细胞分选系统集成了荧光显微成像系统，可以对不同荧光标记的细胞进行检测并计数。在进行质量评估之前，首先要将细胞的培养体系更换成上机所需的Buffer。在这个过程中，需要进行多次离心、重悬操作，Novelbio单细胞实验团队推荐采用水平转子离心机来进行这步操作（下图左）。这种离心机可以有效减少细胞在多次更换Buffer过程中的损失，尤其是对于细胞量较少的样本来说，显得非常有必要。更换完Buffer之后，还需要将细胞进行过筛操作，去除较大的细胞团，获得较为纯净的单细胞悬液。

图2 单细胞重悬、过筛操作

在更换完Buffer之后在实验中，可以通过Calcein AM和Draq7对细胞进行染色，两种染料分别标记单细胞悬液中的活细胞以及死细胞，37℃避光孵育后（下图左上），将细胞悬液加入血球计数板（下图左下），载入BD Rhapsody单细胞分选系统中进行荧光显微成像（下图右），对细胞的状态进行评估。

图3 细胞染色并上机检测

当BD Rhapsody单细胞分选系统对染色后的细胞进行扫描并照相后，根据明场及荧光成像结果，可以对单细胞悬液中的细胞数量、活细胞比例进行计算，进而对单细胞悬液的质量进行评估。结果如下图所示，其中左上、右上、左下分别为同一视野下的明场、绿色荧光、红色荧光结果，右下为数据统计结果，计算并获得了细胞总数及活细胞比例。

图4 细胞计数及活性检测结果

2、细胞铺板

当单细胞悬液满足铺板要求后，就可以进行单细胞分选标记操作了，在这一步，主要用到的仪器和耗材有如下几种，分别为BD Rhapsody单细胞分选仪（下图左上），BD Cartridge单细胞分选蜂巢板（下图右上），BD Rhapsody 电动移液器（下图左下）。

图5 BD Rhapsody单细胞铺板设备及耗材

在单细胞的铺板过程中，由于不同操作人员手法具有不可避免的差异，不同的液体流速将直接影响单细胞的入孔效果。因此BD Rhapsody分选平台还专门配套了定制的电动移液器，其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多种操作模式，来对应各种不同的操作。通过已经设定的程序来控制液体的流速，大幅度降低人为操作习惯带来的差异，保证实验操作的一致性。

图6 BD Rhapsody单细胞分选定制电动移液器

根据已有的细胞计数结果，将单细胞悬液稀释到合适的铺板浓度后，就可以进行铺板操作了。待细胞因重力落入蜂巢孔内后，可以通过BD Rhapsody成像系统对细胞的真实入孔情况进行检测，根据图像结果可以清楚看到每个孔内是否有细胞落入以及落入多少个细胞，统计并评估实际的铺板效果。（下图）。

图7 BD Rhapsody单细胞分选系统细胞铺板情况检测

3、磁珠铺板及清洗

待细胞铺板完成后，就需要往BD&nbsp;Cartridge蜂巢板中加入过量磁珠，来保证大部分孔内都能够落入磁珠（下图左），随后再用Buffer清洗去除多余的磁珠（下图右）。整个过程同样可以通过BD Rhapsody成像系统进行扫描，评估磁珠的实际铺板情况，并统计分析得到细胞和磁珠落入同一孔内的数量，获得细胞的真实捕获情况。<

图8 BD Rhapsody单细胞分选系统磁珠铺板情况检测

4、细胞裂解及磁珠收集

当蜂巢孔内同时落入细胞和磁珠后，接下去可以往BD&nbsp;Cartridge板中加入细胞裂解液对细胞进行裂解，使细胞内的RNA与磁珠上的标签进行结合，完成每个细胞内RNA的捕获和标记。这时，再将捕获了RNA的磁珠进行回收，待所有质控结果确认通过后就可以进行后续的RNA反转录、cDNA第二链合成等实验操作。而BD Cartridge板则需要再进行一次成像，获得磁珠收集后的扫描图，判断磁珠是否已经被有效收集。

图9 BD Rhapsody单细胞分选系统磁珠收集后检测图

5、实验总结报告

根据每一步的质控结果，烈冰科技（NovelBio）单细胞实验团队会根据单细胞分选的实验结果生成实验总结报告，判断每一步骤是否通过质控，并得到最终捕获的单细胞数量以及双细胞比例，对整个实验进行总结评估。若所有过程通过质控，实验样本即可进行下一步实验操作。

图10 实验总结报告

6、烈冰团队助力单细胞研究

从一种新兴的研究角度，借助已有的高通量测序手段，帮助研究者在肿瘤异质性、肿瘤微环境、发育学、免疫学以及其他领域中进行单细胞层面的数据解析，解决了Bulk Population Sequencing所无法解决的问题。这样一个新的研究领域必然也需要足够可靠的实验手段来支撑。BD Rhapsody单细胞分选系统为此提供了完善的硬件设备，保证了从单细胞悬液质量评估到单细胞分选标记过程中每一个实验步骤的精准质控。NovelBio单细胞实验团队借助BD Rhapsody单细胞分选系统，在实验实施层面对单细胞测序结果的可靠性提供了强有力的保证。继单细胞悬液制备之后，又在另一道关键关卡提供了可靠的支持，帮助研究者在单细胞测序领域收获更多的成果。