SPRm 200 分子互作 表面等离子体共振显微镜 应用于药物代谢

Biosensing Instrument 分子互作SPRm 200适用于A431cell，anti-EGFR项目，参考多项行业标准Anal. Chem., 2015, 87 (19), pp 9960–9965。可以检测A431cell，anti-EGFR等样品。可应用于制药/仿制药行业领域。

Epidermal growth factor receptor (EGFR, also known as ErbB-1 or HER-1) is a membrane bound protein that has been associated with a variety of solid tumors and the control of cell survival, proliferation, and metabolism. Quantification of the EGFR expression level in cell membranes and the interaction kinetics with drugs are thus important for cancer diagnosis and treatment. Here we report mapping of the distribution and interaction kinetics of EGFR in their native environment with the surface plasmon resonance imaging (SPRi) technique. The monoclonal anti-EGFR antibody was used as a model drug in this study. The binding of the antibody to EGFR overexpressed A431 cells was monitored in real time, which was found to follow the first-order kinetics with an association rate constant (ka) and dissociation rate constant (kd) of (2.7 ± 0.6) × 105 M–1 s–1 and (1.4 ± 0.5) × 10–4 s–1, respectively. The dissociation constant (KD) was determined to be 0.53 ± 0.26 nM with up to seven-fold variation among different individual A431 cells. In addition, the averaged A431 cell surface EGFR density was found to be 636/μm2 with an estimation of 5 × 105 EGFR per cell. Additional measurement also revealed that different EGFR positive cell lines (A431, HeLa, and A549) show receptor density dependent anti-EGFR binding kinetics. The results demonstrate that SPRi is a valuable tool for direct quantification of membrane protein expression level and ligand binding kinetics at single cell resolution. Our findings show that the local environment affects the drug-receptor interactions, and in situ measurement of membrane protein binding kinetics is important.

SPRm 200 系列 

表面等离子体共振和光学显微镜完美结合

开辟研究细胞膜蛋白相互作用的新前沿

SPRm200是世界上首台将表面等离子体共振技术和光学显微镜巧妙结合为一体的生物传感检测仪。它为免标记研究分子相互作用的领域开辟一个崭新的前沿。专门针对细胞膜蛋白和相关分子免标记检测而设计的SPRm200， 使您在不需要从细胞中提取和分离膜蛋白的前提下实时观察细胞结构并同时测量药物和靶点在细胞上的结合过程。还可进行对药物和在天然状态下的膜蛋白之间相互作用的测量。由于出色的灵敏度和稳定性，SPRm200能够测量纳米尺度上的结合行为，可用于研究细菌或病毒与抗菌性药物的相互作用，以及发展新型药物载递纳米颗粒。

活细胞上免标记生物分子结合过程的检测

     实时亲合力及动力学定量测量像图

     光学和表面等离子体共振同时成像

     药物分子对多细胞或单细胞作用的检测

     纳米尺度上分子结合过程的跟踪检测

 Binding activities of Nano，materials (2um size)

光学显微镜与SPR技术的集成

SPRm200把SPR技术和光学成像结合起来，能够对活细胞成像并将药物分子结合反应定位分布图像实时地表征出来。如图1所示，明场聚焦光源照射于芯片表面固定的细胞，而底部的照相机实时捕获活细胞的图像。同时SPR光源沿共振角度投射于传感器芯片上，由SPRm200检测器测定反射光，并把每一个像素点上的SPR响应信号记录下来组建成SPR传感图。

传统的SPR技术只能在大的整体传感区域内（通常称之为通道）测量平均共振角度的变化，而SPRm200检测器能够测量微小局部中的任何像素上的共振角度变化并且记录每一个像素上的传感曲线图。图2显示了SPRm200同时记录的明场和SPR图像以及图中任何一点或区域的传感曲线图。因此SPRM能提供更多的局部信息，并且可以在研究天然态下的膜蛋白的非均相表面结合过程以及它们和药物之间的相互作用。

                对神经瘤细胞与WGA结合的实时检测：明视场与SPR的同步图像，右边是选择点的SPR传 感图。

凝集素- 糖蛋白相互作用

研究细胞上的信号通道和药物筛选通常首先研究配体与膜蛋白的结合，而研究在天然状态下膜蛋白对于理解其生物功能至关重要。这里是研究糖蛋白（膜蛋白）和凝集素（配体）之间的特异性相互作用以及单个细胞膜上受体的结合活性和空间分布的一个实例。

将神经瘤细胞SHEP1在芯片上培养或固定，然后置于SPRM样品台上。将PBS缓冲液在25度以300 μl/min的流速注入细胞池获得基线。当80μg/ml的小麦胚芽凝集素（WGA）被注入细胞室，仪器可以实时检测到传感曲线的结合段；而当PBS缓冲液冲洗时，仪器也可测量到解离段。每进行下一个浓度实验前，用50 mM GlcNAc 溶液来再生细胞表面上的膜糖蛋白受体。用不同的WGA浓度（5, 10, 40, 80,100, 200 μg/ml）重复对细胞的进行类似测量，则可以得到如图2右所示的一系列传感曲线图。将每个像素的数据予以平均后，可以使用一级结合动力学模型（参见下文）推导出细胞不同部位上的结合动力学参数。我们仪器测量结果与以前发表的数据十分吻合：

nACHRs 的结合行为的定位

nAChR膜受体在神经传递和尼古丁成瘾中起着关键作用，通常测定受体在细胞中的分布使用荧光标记的二抗。由于荧光检测不能提供直接的动力学数据而容易导致假阳性的结论，SPRm200因为直接测量一抗与不含二抗的nAChR的结合，该过程不仅更加简单，且克服了被标记的二抗所引起的不确定因素。

上图中，工程化SH-EP1细胞在膜上表达α4β2 受体，并结合初代抗体抗α4（右图）。通过SPR 像图所显示的nAChR 同其初代抗体结合的分布（粉红色），可以明显看出这是一个非均相的表面结合。用SH-EP1野生型细胞来作为对照， 传感曲线右下图A显示了两种类型的细胞对nAChR的反应具有显著差异。如传感图B中所示，从SH-EP1工程化细胞反应减去野生型细胞反应（主要出于体积折射率效应）可以得到nAChR与其第一抗体的结合动力学，它们分别为kon = 6×104/Ms，koff = 3×10-3/s 和

KD=45nM。

纳米颗粒检测

在纳米尺度上，由一个纳米颗粒所产生的SPR响应信号非常独特。就好像把一个小石子放在一个缓缓流动的浅溪中，水面上就会产生一个波纹图案（参考下图）。SPR光源按共振角度投射到传感器芯片上使其产生一个沿着金属膜表面传播的表面等离子体(SP)波，如图3所示。当一个纳米颗粒结合到芯片表面时，它便成为SP波的发散点，因而会在SPR像中产生波纹图案。其形状远远大于纳米颗粒的实际尺寸（100 倍以上）。这放大的波纹图案使得SPRm200能够检测到粒子尺度远小于其光学衍射的极限，通过对这个放大的波纹图案进行跟踪和测量，就能实现对分子在纳米尺度下结合行为的研究。

细菌和抗生素

大肠杆菌O157:H7 在LB肉汤培养基中通过抗体偶联被交联在传感器芯片上。他们因发散芯片中的SP波而在SPR像上产生许多点波纹如下图右边所示。

参考文献：

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F Zhang, S Wang, L Yin, Y Yang, Y Guan, W Wang, H Xu, NJ Tao, “Quantification of Epidermal Growth Factor Receptor Expression Level and Binding Kinetics

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Wang, Shaopeng, et al. "Label-free imaging, detection, and mass measurement of single viruses by surface plasmon resonance." Proceedings of the

National Academy of Sciences 107.37 (2010): 16028-16032.

参数表：

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