每年公历的7月22日、23日之间,太阳运行至黄经120°时,即为大暑节气。大暑节气正值“三伏天”里的“中伏”前后,是一年中最为炎热的时期。我们的古人又将大暑分为三候:“一候腐草为萤,二候土润溽暑,三候大雨时行。”,大意是每逢大暑时节,由于气温升高又伴有雨水,容易滋生细菌,枯死的植物潮湿腐化,招致夜晚萤火虫在腐草败叶上飞舞觅食;此外,土壤高温潮湿,适宜水稻、棉花等作物生长;同时,在这雨热同季的潮热天气里,天空中仿佛随时都会形成雨水落下,雨量较其他月份明显增多。
由此可见,世间生灵都对温度非常敏感。温度变化影响着万物生息,带来了苍穹大地间的千变万化。从古至今,对于温度的控制和热量的利用,也在人类生活生产中扮演了至关重要的角色。在生命科学研究领域,温度是实验中非常重要的一个参数。例如,使用紫外法测定DNA熔解温度(Tm)就是一项非常经典的需要样品控温的实验。
天然状态的DNA,在比较高的温度下会发生熔解(又称变性):双链DNA(dsDNA)解链为单链DNA(ssDNA),且变为无规则线团。DNA熔解温度(melting temperature, Tm)是使DNA双螺旋结构解开一半时所需要的温度。DNA的变性从开始解链到完全解链,是在一个相当小的温度范围内完成的。并且,在光学性质上会产生“增色效应”,即紫外吸收值升高。所以,我们可以利用紫外可见分光光度计检测DNA样品在260nm处吸光度随温度的变化,对解链过程进行监测。
不同种类DNA的Tm值不同:这是由于鸟嘌呤-胞嘧啶(G≡C)核苷酸之间有3个氢键,而腺嘌呤-胸腺嘧啶(A=T)之间有2个氢键,G≡C核苷酸解离所需能量大于A=T碱基对所需能量。所以,dsDNA中鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对(G≡C)含量越高,其熔解温度(Tm)就越高。由此可见,熔解温度(Tm)可指示不同DNA样品的碱基组成,即G≡C与A=T的比例。
在以下示例实验中,使用梅特勒-托利多紫外可见分光光度计UV7配备酷T(CuveT)恒温器,测定20℃-95℃升温范围内鲑鱼精DNA在260nm处的吸光度变化,以监测其变性过程。我们用各温度点测得的吸光度绘制图谱,可得到一条温度-吸光度S形曲线,如下图所示:
图:260nm处鲑鱼精DNA的熔解曲线
在此实验案例中,鲑鱼精DNA的Tm值通过确定S形曲线的拐点来确定。经测定和计算,鲑鱼精DNA的Tm值为64.4℃,说明其G≡C碱基对的浓度相对较低。确定熔解温度的另外一种方法是用切线法对S形曲线的拐点进行图形化评估。
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