核酸是遗传信息的载体,是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。核酸是以核苷酸为基本组成的生物信息大分子。天然存在的核酸可以分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类。由于20世纪50年代DNA双螺旋结构模型的发现,从分子水平上阐述了生命遗传信息通过DNA的半保留复制进行代代遗传的机理,从此生物学进入了分子生物学的新时代。
核酸在酶的催化作用下分解为核苷酸。核苷酸完全水解可释放出等量的含氮碱基、戊糖和磷酸。构成核苷酸的五种碱基吻别为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其中,腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶存在与DNA和RNA分子中,胸腺嘧啶仅存在于DNA分子中,尿嘧啶仅存在于RNA分子中。DNA存在于细胞核和线粒体内,携带遗传基因,决定着细胞和个体的遗传性;RNA存在于细胞核、细胞质和线粒体中,参与遗传信息的复制于表达。因此,在生命科学的研究中,核酸的测定具有重要的意义。
由于核酸中含有嘌呤和嘧啶碱基,这些碱基都具有共轭双键,因此具有吸收紫外光的特性。紫外可见分光光度计是一种快速简便检测核酸浓度的方法。由于许多污染物在紫外区有吸收,该方法也可用来评估核酸样品的纯度。
如何测定核酸纯度?
DNA吸收光谱实际上是单个核苷酸吸光度的总和。双环嘌呤如腺嘌呤和鸟嘌呤有着较高的吸光度 ,因此消光系数要比单环嘧啶如胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的高。
在260nm波长下,核酸具有最大的吸光度值。
而蛋白质的最大吸收波长为280nm。所以,测定A260/A280的比值可以用来检测蛋白质污染物的存在。对于DNA而言,A260/A280≥1.8;或对于RNA而言,A260/A280≥1.9,则表明样品纯度较高。而当A260/A280比值较低时,则表明样品存在蛋白质污染物。
同理,苯酚、尿素、EDTA,含有肽键或芳香族化合物的分子在230nm波长处有吸收。A260/A230比值在1.8-2.2间表明是纯的核苷酸样品。
有时,我们在脏的比色皿上会检测到320-340nm波长处的粒子吸收,而该处核苷酸是没有光吸收的。所以在320-340nm之间的吸光度常被作为背景扣除。
用什么来测得纯纯的核酸?
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