iCIEF-MS 用于单克隆抗体的电荷异质性分析

　近期，在Analytical Chemistry上发表的一篇文章，为我们展示了一种新的用于抗体药物电荷异质性表征的分析技术——iCIEF-MS，它不仅能获得与SCX-MS类似的分析效果，但同时也表现出了比SCX-MS更为出色的能力，如更好的检测灵敏度、更佳的重复性和更低的残留，这将为蛋白药物的电荷异质性分析提供了一种全新的策略。

　　本文将对文章的部分内容进行介绍，如有感兴趣的读者，可阅读原文章以获取更多内容。

　　原文见：Anal. Chem. 2023, 95, 4, 2548–2560

　　蛋白质的电荷异质性是多种机制综合作用的结果，包括细胞过程、化学降解和制 造过程中的生产条件。例如，许多翻译后修饰(PTMs ) 的发生，包括 c 端赖氨酸截断、焦谷氨酸形成、脱酰胺化、唾液化和糖基化可导致电荷变异体的形成。在上述修饰中，许多修饰会引起蛋白质等电点 (pI) 值的变化，从而对药物的稳定性和溶解度产生负面影响。因此，必须强调需要对电荷变异体进行可靠的表征，以评估关键质量属性 (CQA)，并确保在整个临床和商业开发期间治疗性mAbs的制造过程中保持一致的质量。

　　全柱成像毛细管等电聚焦 (iCIEF) 和离子交换色谱 (IEX)是治疗性mAbs在研发和质量控制中进行电荷异质性分析的两种常用技术。IEX已被开发为MS检测的前端分离技术，在蛋白质表征方面有很大的应用。然而，iCIEF-MS联用技术在发现蛋白质电荷变异体方面仍然还存在的关键瓶颈，包括不令人满意的重复性、复杂的操作以及与MS离子源的不兼容。

CEInfinite iCIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统

　　基于芯片的iCIEF-MS技术平台，使用加拿大AES公司开发的分析与制备一体的CEInfinte系统用于实现快速iCIEF分离，后端使用高分辨率的Thermo Q-Exactive Plus质谱平台进行蛋白质的电荷变异体的鉴定。iCIEF分离部分采用了与MS兼容的两性电解质、不使用甲基纤维素( MC ) 和尿素的毛细管柱，通过创新的微升ESI接口提高检测蛋白质药物电荷变异的灵敏度，这种无缝的MS连接方式使得整个iCIEF-HRMS分析可以在35 min内完成，远远快于传统cIEF-MS，后者通常需要60 min以上。此外，该iCIEF-MS平台通过更换μg级的制备iCIEF毛细管柱，即可灵活切换到 iCIEF馏分收集模式，对蛋白质的电荷变异体组分进行组分收集，并进行深入的表征，包括LC-MS肽图分析、生物相互作用等研究。整合 iCIEF-MS 和基于iCIEF 的馏分收集将进一步有助于在mAb 电荷异质性表征方面建立全面的基于iCIEF 的MS 策略。

图1 iCIEF-MS的原理图

　　利用该iCIEF-MS系统，对9种不同的治疗性mAb的电荷变异体进行表征，并对 iCIEF-MS 的方法进行了系统验证。同时，利用SCX-MS分析了所研究的mAb的电荷异质性。两种手段的分析结果比较表明，iCIEF在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和精确分子量测量精度方面比SCX-MS有明显优势，尽管SCX-MS的分析通量更高。

表1 九种单抗的等电点信息和使用的iCIEF试剂

　　iCIEF和SCX分离9种单克隆抗体的性能比较

　　在最优化的条件下，通过 iCIEF-UV和 SCX-UV 分别分离了9种单克隆抗体，并进行了比较。两种分离工具均在10 min内实现了高通量分离，所研究的单克隆抗体获得了相同的峰序列。首先洗脱的是酸性最强的变体，其次是主峰和碱性变体。对于大多数异质性 mAb 混 合物，iCIEF 基于pI差异的分离度显著高于SCX。在某些情况下，如英夫利西单抗，通过iCIEF可以实现 4 种电荷变异体和一个主成分的基线分离，但使用 SCX 的分离度却不理想。类似地，对于帕博利珠单抗、阿替利珠单抗和地诺单抗，使用iCIEF可以很好地检测出所有电荷变异体； 然而，在使用SCX时，一些电荷变体却丢失了。在分离的选择性方面，尽管 iCIEF 由于不同的分离机制而比SCX具有更宽的峰宽，但由于其pI的细微差异，iCIEF表现出了更好的性能。

图2 九种mAb的iCIEF-UV图谱和SCX-UV谱图

　　iCIEF和SCX 串联MS的比较

　　如图3所示，iCIEF-S和SCX-MS 鉴定了阿替利珠单抗的电荷变异体，并比较了它们的结果。在SCX分离中，MS检测到的酸碱峰顺序与UV一致。而在iCIEF分离中，碱性峰首先被推向ESI源，因此MS检测中的酸碱峰顺序与UV检测的顺序相反。另一个显著的区别是，由于SCX-MS使用更高的流速，从UV到MS检测，柱外的峰展宽程度都较轻，这意味着UV峰形状与MS峰形状更一致。相比之下，iCIEF-MS 较低的迁移流速意味着柱外效应对iCIEF分离的影响更大；从UV 检测到MS检测，峰呈现更为明显的展宽，尤其是主峰，强度更高，并与稍低 pI 的酸性峰部分重叠。这种重叠可以通过使用窄pH的两性电解质和新型的涂层分离毛细管柱，以进一步提高 iCIEF-MS的分离度，以克服峰展宽造成的分辨率损失。

图3 以阿替利珠单抗为研究对象，比较iCIEF-MS 和 SCX-MS分离效果：UV谱图(左)和MS-TIC谱图(右)。

　　iCIEF-MS分析的灵敏度远高于SCX-MS

　　在QE Plus上使用SCX -MS方法分析单克隆抗体时，TIC的响应非常低。以阿替利珠单抗为例，即使将100 μg的 mAb 加载到 SCX 柱上，其主成分的 TIC 响应为 5 E5，电荷变异体则没有被检测到。单克隆抗体在 Orbitrap Exploris 240上的完整质量响应得到了很大提高。如图 3 所示，加载 20 μg 阿替利珠单抗后，主成分的TIC 响应为 3.82 E8。因此，SCX-MS 对所有单克隆抗体的分析在 Orbitrap Exploris 240 上进行，灵敏度更高。

　　与SCX-MS相比，iCIEF-MS 的信号响应更高。虽然 iCIEF-MS的样品载量只有SCX-MS的十分之一，但iCIEF-QE Plus MS的TIC 强度与SCX -Orbitrap Exploris 240 相同（如图3所示）。iCIEF-MS比SCX-MS灵敏度高的原因有两个。首先，iCIEF-MS所用的流速(小于6 μ L/min)远低于SCX-MS所用的流速 (300 μL/ min)。较低的流速导致较高的蒸发效率和MS效率。iCIEF-MS微流体系统的低流量操作显著提高了MS灵敏度，并增加了动态范围，即使样品量低至1 ng 。其次，文章中用于SCX-MS的洗脱流动相的pH接近mAb的pI点 (pH 7~10) ，因此洗脱是在中性碱性条件下进行的。在iCIEF-MS中，补偿液采用含0.5 % FA的50 %乙腈，流速为5 μL/ min，注射泵流速为80 nL/ min。在此比例下，进入MS的最终流动相处于酸性条件。因此，SCX-MS 中性/碱性流动相进入MS，而iCIEF-MS是酸性流动相进入MS，在中性/碱性条件下，蛋白质与质子结合的能力比酸性条件下弱得多，因此与iCIEF-MS相比，SCX-MS在较低的电荷状态下电荷数量较少。处于较低电荷态的蛋白质更容易结合加合物。因此，SCX-MS 洗脱的蛋白质比iCIEF-MS洗脱的蛋白质有更多的加合物。蛋白质的加合物抑制了电离，导致SCX-MS的质谱效率低于iCIEF -MS。

图4 阿替利珠单抗的高灵敏度iCIEF-MS表征分析:不同浓度(0.0 5 ~ 2 mg/mL ) 阿替利珠单抗(A) 的UV谱图，TIC (B) 和 MS(C )谱均为0.05 mg/mL；电荷变异体的浓度与MS响应强度的关系如图(D)所示。

　　iCIEF-QE Plus MS 检测出不同浓度的阿替利珠单抗，见图4。从酸性变异体和碱性变异体的 TIC和MS谱图来看，即使在 0.05 mg/ mL的最低浓度 (3倍S/N的UV信号)下，TIC仍然检测到所有电荷变异体的明显信号。而SCX-QE Plus MS不能达到0.05 mg/ml的检出限。而在已报道的传统cIEF-MS研究中，典型的蛋白质分析浓度为 0.1~ 2 mg/mL。

　　iCIEF-MS和SCX-MS的质量准确度比较

　　除灵敏度差异外，iCIEF-MS的质量准确度也优于SCX-MS。MS检测的准确性取决于MS的分辨率。可达到的质量分辨率不仅取决于仪器的质量分辨率极限，而且受到电离过程的严重影响。加合物使离子信号变宽，因为它们不仅来自于多重质子化的分析物，而且来自于携带加合物的分析物。因此，更多的加合物导致较差的分辨率和较大的质量误差 (较差的精度) 。虽然源内碰撞诱导裂解(CID) 可以将加合物还原为蛋白质，但并不是所有加合物都可以被去除。如表2所示，尽管使用了110 V 的源内CID值，但SCX-MS获得的质谱峰仍然比 iCIEF-MS获得的质谱峰宽，导致SCX-MS 主成分MW 偏差 (5.4 ppm )大于iCIEF-MS (2.7 ppm )。另一个例子是贝伐珠单抗。在没有脱盐预处理的情况下，SCX-MS对贝伐珠单抗的MW偏差高达33.9 ppm。脱盐后进行分析，贝伐珠单抗的偏差降低到 12.8 ppm。而iCIEF-MS，由于加合离子形成较少，即使不脱盐， 获得的贝伐珠单抗的偏差也仅为9.6 ppm。

表2 阿替利珠单抗的电荷变异体的iCIEF-MS和SCX-MS分析结果比较

　　iCIEF -MS 和SCX-MS 的残留效应

　　iCIEF-MS的残留效应比SCX-MS小得多。阿替利珠单抗在分析后，以水作为空白样本用于SCX-MS分析，含4% HR 8.5−9.5两性电解质的水溶液作为空白样本用于iCIEF-MS分析。iCIEF-UV未见明显信号，而SCX-UV 在阿替利珠单抗峰值处检出小信号。SCX-TIC 和iCIEF-TIC的保留时间分别为6.82和21.5 min ，信号峰相对明显。从这两个信号峰提取的MS。通过去卷积，确定SCX-TIC检测到的残余信号是阿替利珠单抗，而iCIEF-TIC检测到的信号只是两性电解质，这意味着iCIEF-MS中没有检测到残余分析信号。低残留率使iCIEF-MS对微量蛋白电荷变异体的检测更加准确和可靠，避免了假阳性结果。

图5 iCIEF-MS和SCX-MS的残留效应的比较：SCX-MS (A-C)显示残留阿替利珠单抗信号，而iCIEF (D-F)没有残留分析物信号。

　　如图4和图5所示，观察到1500~2500 m/z 的背景信号，MS信息证实它们不是蛋白质，而是来自两性电解质和溶剂背景。背景离子不干扰mAb电荷变异体的鉴定。

　　iCIEF-MS鉴定蛋白质的可重复性

　　iCIEF-MS平台的重复性考察结果表明，对阿替利珠单抗电荷变异体的测定表现出良好的重复性。通过iCIEF-MS 进行批次间蛋白质样品鉴定，所有批间检测到的相同电荷变异的质量偏差很小 (<10 ppm ) ，可以保证可靠性和一致性。

图 6 使用阿替利珠单抗进行的iCIEF-MS蛋白鉴定的重复性考察（n=5）

　　9种mAb的iCIEF-MS表征结果

　　表3列出了所有9种mAb的电荷变异体的修饰鉴定结果。酸性变异体的表征比碱性变异体更具挑战性，因为酸性变异体具有更复杂的修饰。虽然这种酸性修饰通常可以通过 pI 来区分，但它们在分子质量上的差异相当小。iCIEF在线串联高分辨率质谱可以通过结合完整的蛋白质分子量和测量的pI值来阐明蛋白质的结构信息，为解决酸性电荷变异体的难题提供一个有用的串联平台。

表3 九种单克隆抗体的电荷变异体的iCIEF-MS表征结果

　　使用 iCIEF-MS 和SCX-MS 来表征一系列不同的治疗性单克隆抗体的电荷变异体可以获得类似的结果。然而，iCIEF-MS 在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和MW测量精度方面比SCX-MS 表现出更多的优势。因此，将iCIEF-HRMS分析与更常见的SCX-MS 相结合，通过正交的验证，可以为分离和鉴别蛋白电荷变异体提供一个有前景且全面的策略。

　　参考文献：略

　　原文请参考：GangWu, ChuanfeiYu, WenboWang. Mass Spectrometry-Based Charge Heterogeneity Characterization of The rapeutic mAbs with Imaged Capillary Isoelectric Focusing and Ion-Exchange Chromatography as Separation Techniques . Analytical Chemistry. 2023, 95, 4, 2548–2560..

　　https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05071

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