文章来源：生物工艺与技术公众号
信使RNA (mRNA) 是蛋白质合成的模板。它作为将遗传信息从细胞核中的DNA转移到核糖体位点、以翻译成蛋白质的中间体。它几乎可以编码任何蛋白质，这使其成为疫苗、细胞和基因疗法、肿瘤治疗和其它应用开发的新方式极具吸引力。COVID-19 大流行推动了大规模的合作，以快速提供针对 SARS CoV2 病毒的疫苗。为了满足这一需求，mRNA 疫苗因其固有的、从设计到药品 (DP) 快速开发的能力而成为首选平台。虽然 mRNA 疫苗已经接受了一段时间的研究，但在大流行之前尚未批准用于人类。整个行业相互作用，扩大了疫苗的生产和交付，使疫苗开发和生产达到了前所未有的速度。
mRNA 疫苗在大流行期间的成功增加了人们对该平台的兴趣。随着该行业恢复到更可预测的生产和需求水平，mRNA 在疫苗和治疗药物中的应用预计将会扩大。与其它疫苗平台相比，其能够提供更快速的产品交付，这种方式在药物开发中变得极具吸引力。截至 2023 年 2 月，超过 140 项临床试验正在使用 mRNA 疫苗，其中 70% 专注于传染病，12% 专注于肿瘤治疗，其余针对其它基因和细胞疗法。该平台还适合连续和先进的生产方式，提供降低成本的潜力。虽然未来 mRNA 产品的范围在其目标上有所不同，但它们的生产过程非常相似，使得它们适合平台化生产，正如欧洲药品管理局最近所描述的那样。
因此，需要就产品质量属性（PQA）和检测方法达成共识。分析测试指南不仅有利于 COVID-19 疫苗，还有其它 mRNA 疫苗以及其它基于 mRNA 的药品，并最终形成可靠的文件和物理标准的基础，以支持不断发展的 mRNA 领域。
支持 mRNA 工艺的分析标准不断增多
针对mRNA的检测，通常包括针对以下质量的方法来评估 DP：
一致性，
内容物，
完整性，
纯度，
效力，以及
安全性。
此外，引入了分析脂质成分和 mRNA 质量属性的方法。这些方法列于表 2 中。添加的原料药 (DS) 分析方法包括基于质谱的方法，用于监测 5'' 加帽效率以及 Poly(A) 尾长和异质性。添加了其它方法来监测杂质，包括 dsRNA、残留蛋白质和残留三磷酸核苷酸 (NTP)。还添加了药品 (DP) 方法来监测 LNP 属性，包括大小、多分散性和封装以及提取方法和其它制备方法，以实现脂质和 mRNA 成分的分离。还添加了评估 RNA 属性的方法，包括大小、完整性、聚集和 DP 水平的定量。此外，还添加了检测表达的 mRNA 编码抗原的方法。其它还包括上游质粒生产的质量考虑因素。
本文提供了有关 mRNA 疫苗和其它基于 mRNA 的产品的产品质量属性的观点和见解，因为它们在未来将成为预防和治疗应用的可行制药实体。在以下两节中，将讨论这些药物的一些历史和特性，包括它们与质量属性的关系、为什么应该监测它们，以及监管指南中将这些成分作为质量属性的测试程序。
mRNA 药物结构及其与 CQA 的关系
mRNA 的生产是利用体外化学酶过程进行的。mRNA 基本上具有四个确定的组件，包括 5'' 帽、上游和下游非翻译区 (UTR)、编码区和Poly (A) 尾。
最初，体外合成面临着 5'' 帽掺入的主要障碍。Natural Cap（通常称为 Cap 0）不能有效地掺入，并且可以以正确或反向的方向定向，使得 Cap 0 的体外合成不可行。此外，为纠正此问题而对帽或相关工艺步骤进行的任何修改都必须产生不被识别为外来 mRNA 的帽，因为这些帽会被宿主防御系统或其它先天免疫系统应答机制（例如干扰素、病原体相关分子模式、病原体识别受体和病毒）迅速破坏。因此，5'' 帽必须与宿主的帽非常相似，同时克服合成问题。人们已经开发出克服这些障碍的替代工艺，例如利用抗反向帽类似物 (ARCA) 和 Cap 1 的方法。这些方法可以避免宿主防御问题，同时克服合成问题。两者都以正确的方向有效整合，尽管前者需要在 mRNA 合成后通过 2''-O 甲基转移酶进行进一步的酶促修饰。必须监测帽掺入效率，这可以使用指南中描述的 RP-HPLC 和 IP RP-HPLC 方法来完成。这两种方法都可以提供帽掺入百分比，并且还可以与质谱联用，以提供准确的质量和精细的结构细节。
UTR 长度和结构是支持翻译效率的调节要素。可以使用 UTR 文库对这些区域中的序列进行优化。BioNTech 使用的源自人 α-珠蛋白 RNA 的 Kozak 序列是用于翻译优化的一个 5'' UTR 的一个示例。目前 mRNA 疫苗中使用的一系列 5'' 和 3'' UTR 已有文章进行了总结。应监测这些区域的质量，因为它们对药物性能至关重要。可以通过确定 mRNA 大小和序列的方法来监测 mRNA，包括 UTR 区域。方法列于表1。
Poly(A) 尾长度会影响 mRNA 的半衰期和翻译效率。最终 Poly(A) 尾长度的优化是开发过程中的一个主要焦点。该部分有助于细胞内的运输并保护 mRNA 免受细胞质中核酸酶的影响。目前的 mRNA 疫苗生产过程利用线性化质粒作为 mRNA 的模板。产生的 Poly(A) 尾的大小可能受到编码质粒的总碱基对容量的限制。编码的 mRNA 越接近容量，可用于编码的 Poly(A) 尾的空间就越少。
其它聚腺苷酸化方法可用于在 mRNA 合成后添加聚腺苷酸尾，例如通过 PCR 或通过聚腺苷酸聚合酶的酶促合成添加。质粒编码合成和 PCR 添加方法都会产生更均匀的聚 (A) 尾，而聚 (A) 聚合酶会产生更多的异质性。无论使用哪种方法生成Poly (A) 尾，此属性都应该是对其长度和异质性将影响药物性能进行监测。这些属性可以通过一系列方法进行监测，例如指南中所述的 IP RP-HPLC。该方法还可以与质谱联用，以提供更多的组成和结构细节。常见方法使用非特异性核糖核酸酶，例如 RNAse H。使用引导引物将酶靶向尾部上游的特定区域。RNAse H 只会切割双链 RNA。因此，从上游引物引导位点产生短寡核苷酸，产生含有尾部的区域，可以对尾部进行定量，以揭示poly(A) mRNA的百分比和异质性。
mRNA 大小和组成是关键属性，可以对其进行密码子优化，以改善表达。可以通过掺入非天然核苷酸（例如 5-甲基尿苷和 N6-甲基腺苷）来生产 mRNA，以减少降解和免疫原性并提高稳定性。可以使用旨在跟踪这些属性的方法来监测序列和大小，例如针对前者的Sanger测序和高通量形式的测序，以及针对后者属性的毛细管凝胶（CGE）和毛细管电泳（CE）。LC/MS 方法还可用于完整质量分析，这对于跟踪修饰的核苷酸掺入非常有用。
表 1. mRNA 药物的表征和放行检测
mRNA 药品特性及其与 CQA 的关系
基于传统的成药性概念，mRNA 不利于作为独立实体用作药物，因为它们的分子量相对较高、带电较多、在生理条件下不稳定，并且会产生不需要的免疫原性。为了克服这些特性，人们制定了利用递送系统的策略，使天然屏障变得无关紧要。在过去的 40 年里，LNP 是一种为实现这一目的而不断发展的递送方法。
LNP 中使用的脂质经过了数十年的研究。累计研究了一千多种合成脂质。那些具有良好药理特性和安全性的药物在药物开发和生产方面取得了进展，可递送包括 mRNA 在内的一系列药物载荷。尺寸范围至关重要，将影响药代动力学质量，例如细胞摄取和流经淋巴管和其它分布系统。
目前，mRNA产品中使用的LNP有四个组成部分：
可电离的阳离子脂质，促进自组装成病毒大小的颗粒并促进内体将 mRNA 释放到细胞质，
脂质连接的聚乙二醇（PEG）已被证明可以延长半衰期，
胆固醇、膜稳定剂以及
天然存在的磷脂或其类似物，支持脂质双层结构。
正确的比例和结构方向是 LNP 功能的关键，也是关键的质量属性。脂质比例和成分可能因药物靶点、递送方法和适应症而异。这些可以通过监控整个 DP 生产过程来控制。含量和成分可通过反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 、荷电气溶胶检测 (CAD)、蒸发光散射检测 (ELSD) 或二极管阵列检测 (DAD) 进行监测。
通常，LNP 生产过程包括四个步骤：形成、尺寸减小、纯化和除菌过滤。最初的粗制脂质体悬浮液及其尺寸减小可以通过溶剂稀释然后进行挤出过程或通过微流体过程来实现。挤出是一种压力过滤程序，其中脂质悬浮液被迫通过具有限定孔径的过滤过程。整个过程旨在限制剪切力等物理应力，并产生均匀的 LNP 成分和尺寸。大小、多分散性和组成会影响 LNP 的摄取和分布，因此是与药物性能相关的重要质量属性。LNP/mRNA 封装过程会将部分 mRNA 置于 LNP 脂质微粒之外。未封装的 mRNA 将迅速降解，因此无助于疫苗功效。可以使用一系列方法来监测尺寸、多分散性和封装，指南中描述了这些方法的示例。
LNP 系统的目标是安全有效地递送封装的活性载荷。为了实现这些目标，生产过程必须提供包封的 mRNA，同时保留关键品质，包括适当浓度（含量）下的正确序列（同一性），同时保持完整性、纯度、效力和安全性。可用于表征和/或放行的检测如下表 2 所示。
表 2. mRNA 药物产品的表征和放行检测
mRNA 药物标准的未来展望
截至 2022 年第四季度，有超过 20 种基于 mRNA 的药物已获得 FDA 批准或处于后期 3 期临床试验中。mRNA 治疗市场预计到 2030年将大幅扩张。大流行期间 mRNA 疫苗的成功推出推动了使用 RNA 生产平台的产品的增长，扩展到一系列治疗应用。举例来说，2021 年针对肿瘤的 mRNA 疫苗试验数量位居第二。与 2021 年相比，2023 年 mRNA 疫苗试验增加了三分之一以上。显然，包括疫苗在内的 mRNA 药物是药品市场的重要增长领域。
原文：J.F.Cipollo, Guidelines For mRNA Drug Product Manufacturing And Quality Control. Bioprocess Online, 2023.