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什么是外泌体？
所有细胞，原核生物和真核生物，作为其正常生理机能的一部分和获得性异常期间释放细胞外囊泡称为外泌体。外泌体是直径为40 至 160 nm（平均 ~100 nm）的囊泡，质膜的连续内陷最终导致多囊泡体的形成，这些多囊泡体可以与其他细胞内囊泡和细胞器相交，有助于外泌体成分的多样性。
根据来源细胞的不同，外泌体可以包含细胞的许多成分，包括 DNA、RNA、脂质、代谢物以及胞质和细胞表面蛋白。产生外泌体的生理目的在很大程度上仍然未知，需要研究。一个推测的作用是，外泌体可能从细胞中去除过量和/或不必要的成分，以维持细胞稳态。研究还表明，外泌体中特定细胞成分的功能性、靶向性、机制驱动的积累表明它们在调节细胞间通讯中发挥作用。
外泌体（EXOSOME）
简单来说外泌体是一种细胞主动分泌的大小均一、直径为40-160nm的脂质双分子层结构囊泡，可由树突细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等多种不同类型细胞释放。外泌体含有多种RNA、蛋白质、脂质、DNA等物质，具有多种生物学作用的一种物质。
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外泌体的应用领域？
由于外泌体的上述特性，近年来相关的研究热度持续升高，作为一种重要的细胞间通讯工具和信息传递载体，在疾病诊断与治疗、 癌症研究、免疫调节、神经系统疾病、心血管疾病、组织工程和再生医学、美容与护肤等领域都有广泛的应用前景。
不同领域的论文报道亦层出不穷，外泌体的临床应用也涌现出很多的成功案例，因此如何稳定保存外泌体、便于运输且不丧失其性状显得尤为重要。
这就不得不提到冷冻干燥技术对于稳定保存外泌体的助力了。
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冷冻干燥技术在外泌体研究中应用
外泌体通常储存在-80°C，然而，一些研究报告表明，外泌体在这种条件下长期储存并不稳定。
● 研究表明，与新鲜分离的外泌体相比，在-80°C下储存4天改变了外泌体的形态；
● 当储存在4°C或37°C时，外泌体的大小减小，表明外泌体的结构变化或降解；
● 此外，即使在-80°C下，2年的储存期也导致外泌体RNA的降解。
这些发现表明外泌体的储存是一个重要问题！
如何解决外泌体储存？
冷冻干燥技术，一种将水分从冷冻状态直接转变为气态从而实现物质的干燥的方法。该技术通过降低温度和增加压力，使水分从冰直接升华为水蒸气，而无需先转变为液态。这种特殊的干燥过程适用于用于保存各种类型的生物材料的技术，例如蛋白质，血浆和脂质体等。冻干可以长期保存而不丧失其生物学活性。这为外泌体的采集、储存和运输提供了方便，并拓展了其在疾病诊断、药物输送以及基因治疗等领域的应用，为其临床研究提供了更多可能性。
冷冻干燥优点多，但依旧有些问题值得注意！
冻干保护剂的选择很重要
冻干过程的温度及应力的问题会对外泌体造成破坏或者聚集。鉴于此，冻干保护剂的选择至关重要！
冻干对外泌体物理性质的影响研究
Chonlada Charoenviriyakul、Yuki Takahashi等人使用了海藻糖，一种由 2 个单位葡萄糖组成的非还原性同型二糖，广泛用作冷冻保护剂对样品进行冻干研究，最后，他们研究了冻干对外泌体物理性质的影响，评估了冻干外泌体和储存在-80°C的外泌体中的药代动力学，外泌体蛋白和RNA含量，以及货物蛋白和DNA的活性。
图1：:实验图形摘要
图2：冻干对外泌体蛋白和RNA含量影响
Effect of lyophilization on exosomal protein and RNA content. (a) Western blots of Alix, HSP70, CD81 and calnexin in exosomes stored at −80 °C (lane 1) and at room temperature after lyophilization with trehalose (lane 2). Representative results are shown. (b) Quantification of band intensity of exosome marker proteins. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n = 3). (c) Lumitein staining of exosomal proteins after SDS-PAGE. Lane 1: marker. Lane 2: exosomes stored at −80 °C. Lane 3: exosomes stored at room temperature after lyophilization with trehalose. (d) PAGE analysis of exosomal RNA. Lane 1: marker. Lane 2: exosomes stored at −80 °C. Lane 3: exosomes stored at room temperature after lyophilization with trehalose. The results shown are representative of three repeat experiments
图3：B16BL6 cell proliferation was promoted by B16BL6-derived exosomes stored at −80 °C or at room temperature after lyophilization. The number of B16BL6 cells after treatment with the indicated concentrations of B16BL6 derived exosomes was determined using the MTT assay. The results are expressed as the mean ± standard deviation (n = 4).
实验结论
实验证明不含冷冻保护剂的冻干导致B16BL6黑色素瘤衍生的外泌体聚集，而添加海藻糖可防止冻干过程中的聚集。PAGE分析显示，在海藻糖存在下冻干后，外泌体的蛋白质和RNA受到保护。冻干对 小鼠静脉注射后高斯荧光素酶（gLuc）标记的外泌体的药代动力学影响不大。此外，发现冻干外泌体即使在25°C下储存，也能保持负载的gLuc和免疫刺激CpG DNA的活性约4周。总之，海藻糖冻干是储存各种应用外泌体的有效方法。
当然海藻糖只是其中一种非常有效的冻干保护剂，但在一个优秀的冻干配方中保护剂、赋形剂、相关的辅料包括目标物质的状态都对冻干结果有着千丝万缕的影响；而且在冻干的同时，还需考虑要冻干过程中的温度、压力等条件再面对不同产品时需要做出的调整，以及PH、装量、运输过程中的机械变化等变量对最终产品的影响。
因此，如果您对选择哪种冻干保护剂存有疑虑亦或是在冻干过程中遇到问题，欢迎随时和莱奥德创交流。
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