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工商注册信息已核实!MALDI-TOF/TOF质谱因其独特的灵活和方便,被用于动物组织中的完整蛋白或蛋白原位酶切的组织成像。完整蛋白成像提供了各种蛋白异变体的信息,蛋白原位酶解成像利用TOF高分辨率和准确度以及MS/MS信息确认酶切肽。
前言
布鲁克rapifleX TOF/TOF质谱仪用于所有MALDI成像数据采集,获得分子量在2000- 24000的完整蛋白质谱图和分子量在600-2400蛋白原位酶切MS/MS谱图。空间分辨率为30μm。SCiLS™ Lab软件用于成像数据的图像处理和统计分析。
结果和讨论
图1和图2显示了小鼠大脑完整蛋白成像的结果。数据分析的第一步,使用无监督多元统计分析进行空间分割[3]。图1所示的分割图反映了小鼠大脑中各个解剖区域像小脑、皮层和其他区域的分子相似性。图1还显示了小鼠大脑各区域在TIC归一化后的特异蛋白质谱。通过有监督单变量统计,即受试者操作特征(ROC),进一步研究了空间分割产生的小鼠大脑皮层和小脑两个不同的聚类,以确定可以明显区别皮层或小脑的某些蛋白。图2顶部的曲线下面积(AUC)与m/z的关系图揭示了与m/z特征匹配的各种组蛋白,表明在皮层和小脑这些蛋白的表达水平存在显著差异。图2中把小脑或皮层两个区域的TIC归一化平均光谱重叠,看到ROC分析检测到的组蛋白空间分布差异进一步显现。小脑平均光谱表明,与皮层平均光谱相比,相应组蛋白的丰度显著增加。另外,MS信号的精细结构解析反映了组蛋白组织特异性的修饰谱信息,代表了Top-down成像方法的独特结果。在四个组蛋白区域中的每个区域,都选择了一个代表性m/z,并生成各自的离子图像(图2下)。这些图像再次证实了ROC结果,并说明这些蛋白质物种在小脑区域明显的共定位。这里的Top-down蛋白成像结果与Lahiri等人[2]早些时候报告的用布鲁克ultrafleX III仪器获得的数据完全一致。而rapifleX MALDI-TOF/TOF以几乎两倍ultrafleX III的像素分辨率进行成像, 采集速度提高约14倍。
图1. 小鼠大脑矢状切面完整蛋白MALDI成像。空间分割2个不同区域的光学图像(左上);分割图(左中);分割树(左下)。空间分割总测量区域(右上)、小脑(右中)和皮层(右下)的平均光谱。
图2:完整蛋白MALDI成像的ROC分析,分割图中小脑和皮层区域的比较。ROC图, 灰色m/z范围是组蛋白区域(上),小脑(棕色)和皮层(蓝色)组蛋白放大区域的叠加平均光谱,(中), 各种组蛋白的离子图像(下)。
图3-5总结了新鲜冷冻小鼠脑切片胰酶酶切后的肽成像结果。肽谱图相似性分析给出了空间分割,显示了小鼠大脑的解剖结构(图3)。特别是分割图中红色的聚类清楚地代表小脑区域。选择MS成像中检测到的不同的肽,进行组织原位MS/MS分析,然后用MASCOT搜库得到的肽序列如图3所示。
图3:小鼠脑矢状切片获得的胰酶切蛋白成像的空间分割。和分割提取小脑区域重叠的光学图像(左上),分割图(左中),分割树(左下). 总测量区域(右上)和小脑的平均光谱(右下). 列表显示了组织原位MS/MS鉴定的肽。
图4:胰酶切肽m/z 931.5+/-0.2Da的离子图像, 丰度最高的区域原位MS/MS用于鉴定组蛋白3.3的酶切肽序列ARTKQTAR。
其中一个被鉴定的肽是源自组蛋白3.3(Mus musculus)的ARTKQTAR m/z 931.54,图4 是它的MS离子图像,以及从最高丰度区域组织的肽原位MS/MS光谱。组蛋白3.3酶切肽在小脑区域的定位与之前描述的完整蛋白成像中观察到的H3组蛋白的空间分布高度一致。为了进一步证明这些结果,采集了酶切肽m/z 931.54的MS/MS图像,其最丰富肽碎片([b+18]7,m/z 775.4)的空间分布如图5所示。所得的MS/MS图像再次显示了组蛋白3.3酶切肽在小脑区域的明显定位,这与完整蛋白以及上述肽MS成像结果完全一致。
图5:组蛋白3.3胰酶切肽ARTKQTAR m/z 931.5的MS/MS图像,MS/MS谱图中生成MS/MS图像的最丰富的碎片离子[b+18]7(红色箭头)。
布鲁克rapifleX MALDI-TOF/TOF质谱作为一个独特的多功能分析平台,能够对不同阶段的蛋白质进行MALDI组织成像, 包括Top-down完整蛋白成像和胰酶切肽MS成像,以及组织原位MS/MS肽鉴定和酶切肽MS/MS成像。这些工作流程可以提供相互补充的信息。虽然Top-down的方法在检测单个蛋白变异体的能力是独特的,但酶切肽的MS和MS/MS成像增加了额外的特异性维度,并允许通过MS/MS分辨重叠的同重肽分子。本实验对小鼠脑组织中组蛋白和其他蛋白质的空间分布,显示了rapifleX多种 MALDI成像方法的能力。结合HTX基质喷雾仪和SCiLS™ Lab分析软件,rapifleX可作为高空间分辨快速MALDI组织成像系统的首选。
参考文献
S. Rauser, C. Marquardt, B. Balluff, S.-O. Deininger, C. Albers, E. Belau, R. Hartmer, D. Sukau, K. Specht, M.P. Ebert, M. Schmitt, M. Aubele, H. Höfler, A. Walch, J. Proteome Res., 2010, 9 (4), 1854–1863
S. Lahiri, N. Sun, V. Solis-Mezarino, A. Fedisch, J. Ninkovic, A. Feuchtinger, M. Götz, A. Walch, A. Imhof, Proteomics, 2016, 16, 437-447
T. Alexandrov, M. Becker, S.-O. Deininger, G. Ernst, L. Wehder, M. Grasmair, F. von Eggeling, H. Thiele, P. Maass, J. Proteome Res., 2010, 9 (12), 6535–6546