基于LC-TIMS-QTOF的尿液样本代谢物分析

发布时间： 2021-09-03 11:51 来源：布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

由于化学和结构的多样性，生物样品中代谢物的鉴定极具挑战性。离子淌度质谱可根据分子的结构大小对化合物进行分离检测，通过碰撞截面积（CCS）值来提供离子形状的信息。使用CCS值、质荷比、同位素分布和MS/MS谱图四维信息来对代谢物鉴定，可提升复杂样本中代谢物鉴定的准确性。尿液代谢物分析可用于表征疾病和药物治疗作用，但由于受到生活方式和饮食习惯等的干扰，使得代谢物的组成更为的复杂。

本文使用LC-TIMS联用，PASEF扫描方式，对尿液代谢物进行分析。收集了80个健康志愿者的尿液样本进行分析，共检测到362个代谢物，并对色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸三个代谢物进行了定量分析。非靶向和靶向分析过程均呈现了CCS值的高度重现性，并使用CCS值对代谢物进行了鉴定。

实验设计

解冻后的尿液样本4℃下离心（1000rpm）1min，取100ul样本使用400ul溶有5uM CUDA的水或乙腈溶解。溶解后的样本再次离心10min中后取100ul到96孔板。

液相使用布鲁克Elute UHPLC，色谱柱选用C18和HILIC。

质谱使用tims TOF Pro，PASEF扫描模式。ramp time 100ms，扫描范围m/z 20-1100；1/k00.3-1.35。

数据处理使用布鲁克代谢组学数据处理软件MetaboScape。数据导入阈值设定为350，TIMS的空间值设为60。数据搜库参数如下：mSigma<20，MS/MS score>850，ΔCCS<1.5% （highly confident），mSigma<50，MS/MS score >400，ΔCCS<3.5%（confident）。

结论

将采集的数据使用MetaboScape处理，进行峰对齐和峰提取，并对质量和淌度进行再校正。最终，C18的数据共导出2378个特征峰，HILIC的数据导出3380个特征峰。数据库检索使用布鲁克HMDB代谢库和NIST 2020代谢物库。CCS值的数据来自于McLean组。最终C18条件下鉴定到129个代谢物，HILIC条件下鉴定到294个代谢物。鉴定流程见图1。

具体的鉴定信息见图2。使用QC样本评价了重现性，96%以上鉴定到的代谢的RSD值在20%之内。同时评价了鉴定结果的ΔCCS和Δppm，95%之内的代谢物鉴定偏差在5ppm内。代谢物实测的CCS值和已有文献值的CCS值（Unified CCS Compendium）进行对比，约有80%的代谢物偏差在2%之内。

同时，为了进一步揭示CCS值在不同实验室不同仪器上的稳定性，选取14个尿液样本在三台不同的仪器上进行数据采集并对比。表1给出了对比结果，偏差在1.3%之内。如此微小的ΔCCS值说明了CCS值测量的可靠性，可以作为代谢物注释的一个重要维度。QC样本中代谢产物的低RSD和代谢产物鉴定的准确性证实了该尿液LC-MS代谢组学分析平台的重现性和可靠性。

淌度在提升鉴定准确性的同时，还可以提供一个额外的分离维度，进一步分离复杂样本中的代谢物。这对于分离具有相近质量但结构形状不同的化合物和同分异构体是至关重要的。例如，我们注意到我们鉴定为腺苷的代谢物在淌度上有明显的分离。腺苷在色谱上只有一个峰，而TIMS的淌度分离可明显看到两个峰，CCS值分别是153.8和159.7Å2。进一步的研究表明，这可能是腺苷的构象异构。

使用LC-TIMS-MS/MS的方法，反相和HILIC的色谱柱分析尿液，共分析到362种代谢物。淌度的引入进一步提高了代谢物鉴定的准确性，而PASEF的高覆盖度的扫描，也使得鉴定数相比于之前的研究结果有了一定的提升。