迈博士有话说
类器官是一个体外构成的具有自我更新，自我组织能力的微型器官，与真实的器官具有相似的空间组织并且能够执行原始器官功能。利用活检技术就可以培养与病人具有遗传相似性的类器官模型，同时意味着可以利用源自患者干细胞的类器官系统来进行个性化药物功效测试，为患者提供更加精准的治疗方法。在本篇文章中，作者利用基质辅助激光解吸/电离-质谱仪(MALDI-MSI)对A549肺癌多细胞球体（类器官）进行分析，以探讨羟氯喹（HCQ）的原位空间分布及其对脂质代谢的影响。
●期刊：Anal Chim Acta
●发表时间：2021.11
●影响因子：6.911
研究背景
模拟复杂肿瘤微环境的三维多细胞肿瘤球体(MCTS)为药物和内源性代谢产物的体外研究提供了良好的平台。羟氯喹(HCQ)已被用于治疗疟疾、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和病毒感染，但最近，该药物因对各种癌细胞具有更好的抗癌活性和对正常细胞较低的毒性而备受关注。已有研究表明，HCQ单独或与其他类型的抗癌药物联合使用，可以通过抑制自噬有效地抑制肺癌、乳腺癌和膀胱癌的生长。然而，该药对MCTS模型脂代谢空间组成和分布的影响尚不清楚。空间代谢组学检测结合脂质代谢组学检测，可以获得更详细的球体对药物和空间分布信息的响应信息，从而有助于更好地理解药物改变的脂代谢与癌症微环境的关系。
研究结果
1. 空间代谢组学检测羟氯喹（HCQ）时最佳基质的选择
在MALDI飞行时间质谱(MALDI- TOF - MS)中，选择合适的基质是获得良好信号的关键步骤。本研究选择CA、DHB、DMCA、HCCA、SA、THAP和3-AQ7种基质，在正离子模式下检测靶板上1 mM羟氯喹的信号。如图1所示，m/z 336.17处的主要离子在光谱中的3-AQ和HCCA基质中都被分配为氢氯喹的质子化形式。值得注意的是，HCCA在所有7个矩阵中产生了最好的信号强度和分辨率。此外，同位素峰(m/z 337.18和338.17处[MþH]þ)也与理论光谱匹配。其他矩阵未产生任何强而可靠的羟氯喹信号。虽然3-AQ可以产生HCQ信号和相对干净的背景，但考虑到3AQ在真空中长时间不稳定，所以选择HCCA进行MS成像。为了研究HCCA对MCTS中羟氯喹信号的检测作用，作者检测了不同羟氯喹处理时间的细胞球切片。结果表明，增加的HCQ信号与治疗时间相关，在正离子模式下研究HCCA基质，得到了类似的HCQ离子峰。同时检测了HCQ的两种主要活性代谢物单乙基羟氯喹(DHCQ)和去乙基氯喹(DCQ)，并通过LC-MS/ MS进行了确认。遗憾的是，这两种代谢物由于浓度较低，无法在MALDI-TOF-MS中观察到。综上所述，在接下来的成像实验中，选择HCCA作为HCQ分析的工作基质。
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图1 优化MALDI-TOF-MS(羟氯喹浓度为1 mM)正离子模式下检测的靶板基质
2. HCQ在多细胞肿瘤球体（MCTS,一种类器官）中的时间依赖性定位
羟氯喹可抑制细胞的迁移和转移，已被用于肺癌等肿瘤的治疗。详细了解羟氯喹在肿瘤细胞中的分布对肿瘤治疗具有重要意义。一般采用LC-MS对样本中的代谢物进行鉴定和定量，但无法获得药物在特定器官和组织中的空间分布。因此，本文使用质谱成像来分析HCQ处理A549人肺癌球体的时间依赖性药物分布。图2A和图S2（见原文补充材料）显示，HCQ的离子信号只在药物处理的球体中观察到，而在未处理的球体中没有观察到。在m/z 320到m/z 350范围内没有其他可观察到的峰(图S2，见原文补充材料)。结果表明，A549球体中没有干扰羟氯喹峰的内源性峰。HCQ浓度在2 ~ 48 h呈上升趋势，72 h呈下降趋势，表明HCQ作用48 h后先聚集在球体中，然后逐渐消失。
这些3D球体在整个结构中展示了氧气和营养物质的化学梯度，形成了一个独特的微环境，其中包括一个具有增殖能力的可存活区域。细胞(外部区域)和具有静止和坏死层的非活性区域(内部区域)。由于氧的有限扩散，可存活区域的厚度被认为在150-200 mm的范围内，这类似于从MSI获得的球体的外部区域(图2B)。因此，提取该肿瘤球体的图像，并通过图像分割(图2B)将其分割成两个感兴趣的区域，这可能是内部区域和外部区域。与球体的外部区域相比，内部区域的HCQ水平更高(图3)。图2C的各时间点，提示HCQ可能具有较低的内含非增殖细胞或死亡细胞的代谢率。相反，活跃增殖细胞的代谢率较高，这可能导致外区HCQ离子信号强度较低。在其他时间点也观察到了类似的区域分布趋势(图3)。
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图2 MALDI-MSI法检测羟氯喹的时间依赖性渗透。(A)不同时间下，羟氯喹(m/z 336.18)在A549球体中的穿透随时间的变化。(B) A549球体的HE染色、球体截面的空间分割图。(C) HCQ内层和外层A549球体的代表性离子峰(m/z 336.18)。
3. HCQ作用下A549肺癌多细胞球体的脂质组学分析析
当细胞与外界环境相互作用时，细胞的脂质组成发生了迅速的变化。在不断变化的环境中，脂肪代谢对细胞的生长和生存起着重要作用。有证据表明，脂类代谢的改变可以解释许多癌症的发生和发展，例如肺癌。本文的结果表明，A549球体中的HCQ强度在HCQ处理48h后达到峰值(图2)。用LC-MS技术分析处理48h后A549球体与未处理的A549球体脂质代谢产物，发现119个脂质类代谢物在未治疗组和HCQ治疗组之间存在显著差异。其中，过半为甘油磷脂(GP)，包括21种磷脂酰胆碱(PC)、18种磷脂酰乙醇胺(PE)、7种磷脂酰肌醇(PI)、5种磷脂酰丝氨酸(PS)、1种磷脂酰甘油(PG)、3种溶血磷脂酰胆碱(LPC)、2种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)。甘油脂(GL)约占总脂质的1/3，包括6个二酰基甘油(DG)和34个甘油三酯(TG)。其余为鞘磷脂，涉及11个神经酰胺(Cer)，2个葡萄糖神经酰胺(CERG)，9个鞘磷脂(SM)，如热图所示(图3A)。为了研究脂质组成的变化，鉴定出的总相对丰度在Cer、CERG、DG、LPC、LPE、PC、PE和PI中显著上调，而在PG和TG中显著下调(图3B)。
脂质在细胞功能中起着重要的作用。鞘磷脂代谢产物，如SM和Cer，是细胞膜的结构成分，也是细胞凋亡、转移和耐药信号的第二信息。GPS和GLS是细胞膜的组成，GLS还具有储能功能。在A549球体中发现PC和PE水平增加，这与抗癌药物治疗下的结直肠癌细胞球体类似。DG水平升高和TG水平降低可能与A549球体的脂肪生成有关，这可能是由药物耐药性引起的。PG是存在于线粒体膜上的心磷脂(CL)的前体。PG的下调会导致CL缺乏和线粒体功能障碍，进一步与细胞凋亡和癌症有关。
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图3 用LC-MS/MS分析HCQ治疗后A549球体中的脂类组学变化。(A)HCQ治疗后鉴定的脂类的热图分析。(2)HCQ治疗组和对照组的倍数变化。亚类脂类的相对组成(n=7)。(*P<0.01，**P<0.001)
4. A549肺癌多细胞球体内脂质的空间分布变化
根据图像的空间分布特征将图像划分为两个感兴趣区域，这与HCQ处理后的球体内部和外部区域一致。通过对球体的MALDI-MSI分析，对两组间脂代谢产物的变化进行多因素五聚类统计分析。概率潜在语义分析(PLSA)计分图显示，在正负电离模式下，两组球体的内外区域有明显的图形分离(图4)，表明它们具有不同的脂质成分和分布。
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图4 A549球体中不同区域的MALDI-MSI图谱的pLSA。(A)正电离模式；(B)负电离模式
LC-MS/MS结果(图3)显示了整个球体的总体变化。然而，仅通过LC-MS/MS分析球体不同区域的脂类物质的调节尚不清楚。为了揭示这些途径中与癌症代谢相关的脂质信号分子，使用ROC分析从pLSA结果中区分未处理和HCQ处理组的选定和鉴定的脂质。与未处理组相比，经HCQ处理的球体内部或外部区域的脂质种类的MS图像发生了显著变化(图5A)。结果显示，内、外球体m/z 714.51处的[PE(34：2)-H]-归一化强度高于未处理组相同区域的归一化强度，ROC值分别为0.970(内区对内区)和0.981(外区对外区)(图5)。其他脂质种类，如[LPI(18：0)H]-和[PS(34：1)-H]-在HCQ处理的球体内和外区域具有相似的空间分布模式。在m/z 768.56处上调的[PE(38：3)-H]-位于HCQ处理的球体的外区，其AUC值为0.836(图5)，而内区的AUC值为0.558，无显著差异。[PS(36：2)-H]-m/z 786.53处也有类似的分布格局。相反，m/z 764.51处的[PE(38：5)-H]-上调仅在经HCQ处理的球体(Auc/0.885)的内部区域被发现(类型III，图5)。此外，还发现，在HCQ处理的球体内，PI[(38：3)-H]-在m/z 887.56处的分布模式下调，AUC值为0.750，而在外区上调，AUC值为0.861(类型IV，图5)。这些图像显示，强度的差异可能由球体内(非增殖或死亡细胞)和外部(增殖细胞)区域的不同细胞类型解释，这对脂肪代谢有不同的影响。如上所述，LC-MS/MS结果有助于脂质物种的分析，但它们只能观察到匀浆球体中脂质物种的上调或下调。然而，利用MSI，球体内外区域的脂质物种的强度变化不同，这为药物处理的球体对脂质代谢产物的反应提供了详细的信息。综上所述，MSI结合LC-MS/MS可以作为一种有用的工具来揭示药物治疗时球体内脂质代谢产物的变化。
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图5 (A)A549肺癌细胞球体内外区域脂质离子在未处理组(左)和羟氯喹处理组(右)之间的分布。(B)箱线图表示未处理组和HCQ处理组的内部和外部区域的强度。红点表示异常值。*AUC>0.75.。比例尺：200 mm
研究结论
本文建立了一种MALDI-MSI方法，并应用于研究HCQ及其对A549肺癌细胞肿瘤球体中脂质成分和分布的影响。MSI结果表明，与球体的外部区域相比，HCQ主要在内部区域的定位和聚集。脂质MSI结果表明，HCQ处理显著改变了内、外区域的脂质种类，呈现出四种类型的空间分布格局。此外，还进行了多元统计分析，包括脂谱的PLSDA和MALDI-MSI数据的PLSA，以考察HCQ处理下的脂代谢变化。LC-MS差异倍数分析表明，HCQ处理后，Cer、CERG、DG、LPC、LPE、PC、PE和PI等多种脂类均显著上调，PG和TG显著下调。
该方法可用于抗癌药物治疗下的体外研究中内源性代谢物的原位分布，为这些代谢物对药物的反应提供更详细的信息。
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图 MALDI与ESI物质二级谱图具有差异
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