自发荧光高？光谱流式来帮忙！

什么是自发荧光?

自发荧光即细胞发出的荧光，是由于某些生物结构（如线粒体和溶酶体等），在光下会发出荧光这一自然规律所造成的。大部分的荧光来自NADH、核黄素和黄素辅酶1。自发荧光是流式细胞术所面临的一个挑战，较高水平的自发荧光会干扰相关阳性群体的分辨率。

当使用的荧光分子比细胞发出的自发荧光亮很多的时候，自发荧光不会造成太大的影响；但当自发荧光与荧光分子发出的光量接近时，流式细胞实验就会受到很大的干扰。

改善高自发荧光样品的数据质量

Cytek Aurora 和 Northern Lights的全光谱检测和分析技术，可以实现自发荧光去除，使进一步提高数据的清晰度成为可能。某些样本类型，如酵母菌和肿瘤样本，存在较高的自发荧光，基于这些样本开展的流式细胞实验，是具有高度挑战性的。Cytek光谱流式细胞仪独特的光学检测系统，能够对未染色的细胞发出的自发荧光进行检测并获得其全光谱特征。配套SpectroFlo 软件的解析算法，在需要的情况下，可以将这些自荧光光谱作为一个单独的参数，从荧光数据中剔除出去。

利用Cytek光谱流式检测高自发荧光样品的应用实例

PrimeFlow™ RNA 检测

未染色和用Alexa Fluor®488标记的细胞在Aurora上获取后，发现两者荧光光谱很相似，重叠严重（图3左）。由于细胞的高自发荧光，阳性和阴性信号的分界是模糊的。去除自发荧光后，两个细胞群体的分辨率被大大提高了（图3右）。

HeLa细胞的 mCherry 表达

用携带mCherry报告基因的CRISPR-Cas9靶载体转化HeLa细胞。mCherry的表达受敲入基因的内源性启动子驱动。感染后32小时收集细胞，用Cytek Aurora 流式细胞仪（四激光配置-V,B,YG,R）进行检测分析，评估mCherry荧光蛋白的整合情况。未染色的和携带mCherry的细胞发出的光谱在黄绿色通道中表现出差异。当不去除自发荧光时，阴性和阳性细胞几乎无法区分；去除自发荧光后，阳性细胞的分辨率被大大提高（图4）。（样品由EMBL （欧洲分子生物学实验室）流式细胞仪和细胞分选部门的Malte Paulsen提供）

酵母的CFP和GFP 数据

如Thacker等人在参考文献2中所述，构建携带荧光蛋白报告基团的酿酒酵母菌株，以研究减数分裂的分离模式。在科罗拉多州立大学的Lucas Argueso实验室，使用四分体分离方法分离了分别表达CFP或GFP的对照菌株。这些菌株会在孢子形成时持续性地表达其中一种荧光蛋白。由于酿酒酵母的孢子拥有细胞壁、质膜和子囊（容纳孢子的囊），因此酵母有大量的自发荧光。在Cytek Aurora 流式细胞仪（三激光配置）上获取这些酵母样本，鉴别他们的自发荧光光谱特征，并对去除和不去除自发荧光的情况都进行了分析。全光谱特征和解析后结果的比较如图5所示，可以看到去除自发荧光后，细胞群落的分辨率的得到了很大的改善。

参考文献

1. Aubin, JE: Autofluorescence of viable cultured mammalian cells. JHistochem Cytochem 27:36–43, 1979.3

2. Thacker, D., Lam, I., Knop, M., & Keeney, S. (2011, October). Exploiting spore-autonomous fluorescent protein expression to quantify meiotic chromosome behaviors in Saccharomyces cerevisiae. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21840861