视频回放&问答集锦—Cytek光谱流式网络课堂科研专场

7月2号，Cytek第二期网络课堂如期举办，本期讲座邀请到了美国马里兰大学医学院的范晓轩教授，介绍了他基于Cytek Aurora 光谱流式细胞仪开展科学研究的实战经验，并分享了他们开发的23色、29色实验及数据。同时也有来自Cytek的专家分享了许多利用光谱流式技术开展的科研应用进展。讲座吸引了很多对光谱流式技术及其科研应用感兴趣的流式用户和研究者，也提出了很多感兴趣的问题，由于时间的限制，网络课堂播出时我们只选择性的对部分问题进行了解答。讲座结束后，我们将部分还未回答的问题（范教授讲座部分）跟范教授进行了线下交流，并与已回答的问题一起整理和发布出来，反馈提问者及感兴趣的用户。

下面就是这期讲座的问答集锦和视频回放

Q1：根据您过往的流式经验，您认为光谱流式的解析结果准确吗？

答：我认为是很准确的。除非像我所说的，有时Beads Control、Cell Control都不prefect，这种情况很少，这时就需要你每次都check一下compensation是否perfect。而且这种不完美的情况，是我在做多色方案，如23 color、30 color时才可能会出现，如果只做4色或6色，那基本没有出现过不准确的问题。只有当你在做enough color时这些细小的问题才可能出现。传统流式中根本达不到那么多颜色，也就不会产生完不完美的问题。现在Cytek Aurora可以达到那么多颜色，只是有一些小瑕疵需要check而已，并且颜色少时完全没问题。

Q2：从操作层面来看，您觉得相较于传统流式是否更方便？或有什么不同之处？

答：我认为最大的优势是它能够自动update你的detector setting。根据你每天run的QC Beads，你的detector setting是浮动的、可变的。我再举一例，传统流式细胞术是一对一的，我做compensation，我的PMT、电压需要保持一致，只要compensation调好了，后面的PMT、Voltage都不能变，因为它决定了我的spillover的多少。

但我发现在Cytek Aurora上，你做完了unmixing，然而想改变detector setting是可以的。一开始我得知Cytek Aurora上可以做时，我第一反应是这是Mission impossible，是不可能的，随后我们尝试改变了每个detector setting，并用这些crazy setting重新record file，发现它的unmixing是完美的。按我的理解，它能做到这一点是因为它每个detector 的gain setting和它的fluorescence intensity对应的非常好，我的gain setting变动到什么位置，fluorescence也相应的变动到对应的位置，它的线性范围做的非常好，因此哪怕改动了detector setting，unmixing还是对的，这就表现出了system非常强大，即使detector setting 改变了，我的compensation还是可以用的。

Q3：除了可自动调节之外，您觉得光谱流式是否还有其他的优势？

答：除了刚才讲到的，还有就是small particle的优势很大。我有一些客户是从费城等一些地方专门坐火车过来用我的Cytek Aurora做小颗粒的分析。就像我所说的，它的Signal-to-Noise Ratio（信噪比）做得好，它sensitive enough to distinguish degree，所以它能够把detector 调的很sensitive。另一个优势就是我说的自发荧光去除，有时background很高，这样autofluorescence reduction之后resolution能够变得很好，只有一个要求，你要有enough signal。对待自发荧光就像对待单染对照一样，要有足够的信号来设置它的光谱特征（enough signal to set this fingerprint）。一般的signal要是达到了10的四次方左右才用这个function。

以前我做3 laser时很少用到autofluorescence reduction，因为很多时候我的signal background没有那么强，但当我添置了第二台Aurora，增加了UV laser之后，因为UV range 的autofluorescence很强，所以它给了我很大便利，虽然我UV的背景强了，但是我的数据更好看了，这就是Cytek Aurora的特点。

Q4：请问在您的使用过程中，这个仪器的稳定性如何？

答：稳定性可以说是很好的。比方我若是做unmixing，我不做single color control，只在第一天做一次，后面的几个月都用同样的unmixing，效果都是很好的。你看laser delay，若机器有问题，绝大多数情况是它的fluidics system有问题，它的 laser delay每天和每天变得很多，而Cytek Aurora每天和每天的 laser delay基本很少，所以它的fluidics system做得很稳定。

Q5：从平台的角度，光谱流式和传统流式的管理上有何不同？

答：管理上我认为就是user education的问题，若要把新的观念传输给用户是需要花费时间的。若教授一个从未学过流式的新用户去使用仪器，Cytek Aurora可能会更易学。现在主要的问题是如何使一些用传统流式的老用户去接受光谱流式的使用。对于软件方面我觉得光谱流式的软件非常好。

Q6：从您的PPT显示看，为什么BV421的Stain Index低于LSR2呢?

答：在短波长，APD detector 的quantum efficiency 相对于PMT的优势并不大。并且Aurora上，bandpass只有15，最窄的一个。LSR上是50，接受的光子多很多。我想到的是这两点，不过BV421非常亮，低一点反而对多色更有利。

Q7：既然硬件都好于LSR，灵敏度为什么不如LSR呢？ 

答：灵敏度，Aurora应该远远高于LSR.

Q8：有听闻一些分析说光谱流式的信号比传统流式的信号弱一些，请问您实际体验有这样的发现吗？光谱流式对一些比较弱的胞内cytokine信号、或者phosph-flow的检测是否灵敏呢？

答：弱信号更应该用Aurora Stain index的数据说话。而且可以subtract autofluorescence，更有优势。

Q9：感觉散点图上有的横坐标或者纵坐标上阳性和阴性的分离不是很开，可以在最初setting时通过设定改善吗？

答：Setting 是Cytek在用户端安装时根据QC beads 的结果调好的。兼顾了每一个channel的performance和其他颜色的unmixing效果. 没有特殊理由，我尽量不去调setting。当detector的gain setting 达到其最佳检测效果的阈值后，增加gain，并不能显著提高stain index。而这个阈值普遍很低，Cytek设好的setting 应该远在这个阈值以上。

我认为目前的显示对于普通用户已经足够好了。我的图上为了显示rare population, 显示的events 多，少显示一些，会看到separation 还是不错的。

Q10：清洗仪器有什么要特别注意的吗？

答：清洗仪器没有特别注意的，按Cytek推荐的流程操作即可。

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