新思路设计新药-LCMSMS微量靶向技术对单胺类神经递质的微透析液分析

发布时间： 2020-03-30 23:13 来源：上海鹿明生物科技有限公司

编者按

新型冠状病毒牵动着全国人民的心。一边是源源不断流向疫情重灾区的物资、捐款，在凛冬里让人倍感温暖；一边是迅速攀爬的冰冷数字和让人恐慌的最新报道。因此早期各界针对新冠治疗的特效药备受关注，直到1月20日,钟南山院士指出:新型冠状病毒感染的肺炎没有特效药，这似乎给了人们重磅一击。

在制药研究及新药设计中，研究技术和方法是其中重要的一环。本期小鹿带来梅茨制药有限公司生物分析部报道的运用LCMS/MS靶向代谢组学技术对单胺类神经递质研究，这在解释疾病机制方面发挥重要作用，进而为设计新药提供线索方法。

前言

梅茨制药有限公司生物分析部在Analytica Chimica Acta杂志发表题为“Microdialysate analysis of monoamine neurotransmitters—A versatile and sensitive LC–MS/MS method”的研究论文，本文作者开发并验证了一种同时测定大鼠脑微透析液中多巴胺(DA)、去(NE)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质(LC/MS/MS)的灵敏方法。

英文标题：Microdialysate analysis of monoamine neurotransmitters—A versatile and sensitive LC–MS/MS method

中文标题：单胺类神经递质的微透析液分析——一种多功能、灵敏的LC-MS/MS方法

材料：未成年雄性大鼠

影响因子：5.256

发表期刊：Analytica Chimica Acta

主要运用生物技术: LC–MS/MS

研究背景

单胺类神经递质是一种小的极性分子，介导神经元和突触周围其他细胞之间的信号传递。在许多神经系统疾病如阿尔茨海默病或帕金森氏病中都可以看到各种反式功能障碍，在某些疾病中甚至可能是一种主要的机制。在中枢疾病或中枢疾病模型出现时，监测到大脑细胞外空间神经递质浓度的动态变化，在解释疾病机制方面发挥重要作用，进而为新的治疗方法提供线索方法即设计新药。因此，开发一种用于不同生物基质中神经递质精确定量的分析方法一直是的研究热点。本文作者开发并验证了一种同时测定大鼠脑微透析液中多巴胺(DA)、去(NE)和5-羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质(LC/MS/MS)的灵敏且快速的方法。

研究思路

研究方法

1. 样品准备

1.选取未成年雄性大鼠（240-360 g）单侧用硅化导管，植入异氟醚麻醉剂三天；

2.采用微透析探针通过引导套管进入CPu(探针针尖腹侧位置，参照头骨:7.2mm)取样前约12h以流量为2L/min-1，使用灌注泵注入人工脑脊髓液（aCSF）aCSF的成分为147 mM Na⁺，2.7 mM K⁺，1.2 mM Ca²⁺，0.85 mM Mg²⁺，0.04 mM抗坏血酸。

3.样品采集，开始灌注后一小时，以三个20分钟的计数开始收集样品。此后，向每只大鼠注射。然后用馏分收集器自动收集样品（40 µL）240分钟（12个样品）；

4.在深孔收集板中，向30 µL微量透析液样品中加入10 µL IS溶液；

5.然后加入10 µL盐缓冲液（pH 8.5，0.1 M）和30 µL 1 mM SPTPP溶液，将混合物在Thermomixer上于50°C加热混合 10分钟；

6.向其中加入10 µL的含有10％（体积）的水：（80:20），并将溶液振摇5分钟。将待测样品分成6等分在LC / MS / MS系统中检测；

2.检测方法

通过在TurboIonSprayTM接口中注入每种衍生化合物的溶液，在MRM模式下进行定量，优化了其MS参数。通过增加电喷雾电离的电离效率提高了灵敏度。将衍生物的分子量[M]⁺设置为检测离子，并调整去簇电压（DP），以达到最丰富的m / z比。选择了最强的产物离子进行定量，并针对每个质量优化了碰撞能（CE）和碰撞室出口电压（CXP）。

表1 |DA、NE、5HT三种化合物及其内标的质谱条件

实验结果

图1 | 衍生化后DA、NE、5HT三种化合物的ESI/MS/MS图

表2 |校正回归参数（n=3）

LC-MS/MS平台获取每种分析物及其同位素标记的内标物的保留时间和最大信号（峰面积）。使用Analyst 1.5.1软件对数据进行批量处理，分析物与内标物的峰面积比（Aanalyte / AIS）被用作分析物的响应。通过对校准标准品的峰面积比（y）和浓度（x）进行线性回归分析，生成标准曲线。由于动态范围较宽，因此使用加权因子（1 / x²）来建立校正曲线。三个批次中所有三种神经递质（NT）的平均相关系数都在0.9990和0.9996之间。

表3 | 日内精密度和日间精密度

通过分析90pm (QL)、20000 pM (QM)和40000 pM (QH)三种不同批号的加药样品的6个重复，评估了日内和日间的精密度与变异系数。结果显示所有三种神经递质（NT）的日内精密度在3.35 ~ 4.76%之间。变异系数不超过6.31%。表明该方法稳定可靠。

图2 | 衍生的双空白基质样品（人工CSF）的SRM色谱图

通过分析浓度为30 pM的衍生标准物并根据S / N = 3：1的色谱图（图3）计算LOD。在DA离子色谱图中，在2.7分钟处的宽峰被发现是衍生试剂的水解产物。5-HT离子迹线上1.7分钟处的峰被鉴定为NE-d6的同位素杂质峰。两个峰均与分析物良好分离且不会干扰，分析发现DA，NE和5-HT的检出限分别为7 pM，13 pM和1 pM。

图3 | 在IS 111 µM，NT的进样浓度为10 pM时LLOQ的aCSF DA，NE，5-HT及其同位素内标的SRM色谱图

研究结论

在本工作中，已开发并验证了用于测定多巴胺，去和5-羟色胺的液相色谱质谱法（LCMS/MS）。该方法已经成功地应用于大鼠纹状体微量透析液样品中这些神经递质的定量分析，色谱分离时间（总运行时间为3分钟）。衍生化反应在非常温和的条件下进行，样品可以在96孔板上进行收集，适合样品量少，高通量分析。文章作者通过执行不同的测试，如线性，准确度和精密度（日内和日间），短期和自动进样器的稳定性以及再进样，对此方法进行了方法学验证。

小鹿推荐

本次研究已开发并验证了用于测定多巴胺，去和5-羟色胺的液相色谱质谱法(LCMS/MS)。该方法成功地应用于大鼠纹状体微量透析液样品。与其他相比此方法不仅检测时间上得到了提升，且通过衍生化的方式增加神经递质（NT）的疏水性及其在C18固定相上的保留，因此可以从基质上进行色谱分离，避免了其他一些方法中由于无机盐浓度高而产生的信号抑制。十分值得借鉴。

部分文献参考

[1]A. Carlsson, J. Neural. Transm. 109 (2002) 777–787.

[2]M. Perry, Q. Li, R.T. Kennedy, Anal. Chim. Acta 653 (2009) 1–22.

[3]Z.D. Sandlin, M.S. Shou, J.G. Schackman, R.T. Kennedy, Anal. Chem. 77 (2005) 7702–7708.

[4]Y.M. Liu, C.Q. Wang, H.B. Mu, J.T. Cao, Y.L. Zheng, Electrophoresis 28 (2007) 1937–1941.