排糖减重，CLIN CHEM |运用GC-MS非靶与靶向代谢组学研究多囊卵巢综合征与肥胖之间的关系

前言

 

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄妇女中最普遍的内分泌疾病，本文为西班牙马德里大学糖尿病、肥胖症和人类生殖研究组在clinical chemistry（IF=6.891）发表题为“Metabolic Heterogeneity in Polycystic OvarySyndrome Is Determined by Obesity: Plasma Metabolomic Approach Using GC-MS”的文章。文章报道了针对腹部肥胖和肥胖会影响多囊卵巢综合征（PCOS）与胰岛素抵抗和糖尿病的关系研究，运用GC-MS平台研究描述多囊卵巢综合征和肥胖相关的中间代谢表型。
 

 

中文标题：肥胖对多囊卵巢综合征代谢异质性的影响：GC-MS血浆代谢组学研究

样本：人血浆

发表期刊：Clinical Chemistry

影响因子：6.891

技术手段：GC-MS非靶向代谢组学检测、GC-MS靶向代谢组学验证

 

研究背景

 

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄妇女中最普遍的内分泌疾病。PCOS以雄激素过多为特征，并与肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等代谢性疾病有关。患有PCOS的女性中糖耐量异常和糖尿病的发生似乎主要取决于与胰岛素抵抗的相关性，肥胖起主要的触发作用。是否所有多囊卵巢综合征患者的糖尿病风险增加与肥胖无关，或仅与肥胖患者和有其他危险因素的非肥胖患者有关，仍存在争议。

 

无假设的基因组学和蛋白质组学技术在PCOS研究中的应用证实了胰岛素抵抗和低度慢性炎症参与了其发病机制，但同时也揭示了与铁代谢、Wnt信号传导、氧化应激、免疫功能和脂质代谢有关的代谢途径参与该普遍疾病的发病机理。代谢组学的目的是鉴定和量化生物系统中所有代谢物，与基因组学、转录组学和蛋白质组学相比，代谢组学提供了最能预测表型的数据。

 

为了提供肥胖对多囊卵巢综合征（PCOS）常见代谢紊乱影响的新见解，研究者采用GC-MS非靶向代谢组学方法研究绝经前妇女PCOS和肥胖的中间代谢表型。

 

研究思路

 

 

研究方法
 

1. 实验设计

实验对象选择：

从36例多囊卵巢综合征患者和39例没有雄激素过多或排卵功能障碍的对照妇女中选择血浆样本。使用年龄和体重指数（BMI）作为评价标准，从患者和对照组的历史数据库中选择这两组血浆样本，以避免选择误差对代谢物或激素特征造成影响，同时选择年龄相近样本作为甄选条件。BMI≥30kg/m2。

 

实验准备条件：

1.过去的6个月里，实验对象没有高血压、糖尿病或心血管的个人病史，也没有接受过口服避孕药、抗雄激素、胰岛素增敏剂、铁补充剂或可能干扰血压调节、血脂或碳水化合物代谢的药物的治疗。

2.为期3天的300克碳水化合物饮食和12小时的夜间禁食之后，在月经周期的滤泡期或闭经期间获取血清和血浆样本。

 

2.样本前处理

血浆等份（100μl）解冻，将样品短暂地旋涡，每一份加20μL内标溶液（1μg /μLL-琥珀酸-d4）。然后加入900μL冷甲醇/水=8：1（V/V），超声4min后涡旋10s。随后在冰上保存10min。离心10min（19000 g，4°C）后，将400μL上清液分两次转移到GC自动进样瓶，添加20μLL-肉豆蔻酸-d27。最后，使用冻存冷冻干燥机将混合物冻干。

 

衍生化：将冻干样品与50μL吡啶中的甲氧胺（0.3μg /μL） 在室温下反应16h。为了增加化合物的挥发性，再用30μLN-甲基-二甲基硅基三与1%三甲基在室温下反应1h。

 

 

研究方法
 

1.GC-MS非靶向代谢组学检测

在恒压模式下将压头压力调整至16.727分钟（17.5ψ）参比化合物肉豆蔻酸。衍生化样本（1μL）被注入气相色谱仪系统，带有一个分流入口（分流比5:1），配有J&W Scientific DB 5-MS+DG固定相柱（30 mm X内径0.25mm，0.1μm薄膜）耦合到HP5973质量选择检测器。将柱温保持在60°C下1min，然后以10°C/min的速率增加到325°C，最后保持在该温度下10min。探测器在电子碰撞电离（70 eV）扫描模式下运行。在溶剂延迟4min后，以2.46次扫描/s（质量扫描范围为m/z 50-600，阈值丰度为50个计数）记录质谱。源温度为230°C，四极温度为150°C。使用由混合血浆组成的QC样品来检查GC-MS系统的重现性。每12个研究样本插入1个QC样本。

 

2.GC-MS靶向代谢组学验证

从36名患者和39名GC-MS非靶向代谢组学分析的对照组中随机抽取40份血浆样本。这些样本分别对应于20例PCOS患者和20例对照组。两组中，10名女性为非肥胖者，10名为肥胖者。在同一台GC-MS单四极杆仪和色谱柱上进行了定量分析，并对色谱条件稍加改进和优化。质谱仪采用单离子监测模式。根据相应的目标离子对代谢物进行定量，并根据其限定离子和保留时间对其进行鉴定。

 

实验结论

 

一.与对照组相比，PCOS患者的临床和激素特征表明PCOS患者与肥胖之间没有统计学上的显著交互作用。

作者发现PCOS患者和对照组的年龄和BMI没有差异。然而，在不考虑肥胖的发生下与对照组相比，PCOS患者的腰臀比、多毛评分、游离睾酮、硫酸脱氢表雄酮和空腹胰岛素浓度升高，空腹血糖和胰岛素敏感性指数值降低（表1）。

 

表1 |与没有高雄激素血症或排卵障碍的对照组妇女相比，PCOS患者的临床和激素特征

 

整体来看，肥胖女性的体重指数和腰臀比增加，游离睾酮浓度、空腹胰岛素、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯浓度、性激素结合球蛋白和高密度脂蛋白胆固醇浓度降低，与非肥胖者相比胰岛素敏感性指数降低（表1）。作者发现多囊卵巢综合征的状况与肥胖之间没有统计学上的显著交互作用，表明多囊卵巢综合征的影响在非肥胖和肥胖妇女中是常见的。反之亦然，肥胖对多囊卵巢综合征患者和对照组的影响是相同的（表1）。

 

二.GC-MS非靶向检测及GC-MS靶向验证结果显示PCOS与肥胖之间存在统计学意义上的相互作用

表2总结了GS-MS非靶向代谢组学研究多囊卵巢综合征与肥胖之间相互作用得出的详细峰值注释、分配和单变量统计分析。无论肥胖程度如何，多囊卵巢综合征患者的2-酮异、生育酚、丙氨酸和胆固醇均低于对照组（图1A，表2）
 

图1| 代谢物在m/zRT强度上表现出差异

 

相反，无论多囊卵巢综合征如何，非肥胖女性与肥胖女性相比，柠檬酸、甘氨酸、葡萄糖酸内酯、苯丙氨酸和棕榈烯酸的含量或高或低（图1B，表2）。肥胖影响甘油、乳酸和油酸，但PCOS组和对照组的影响不同（图2，表2）。

 

表2 |GC-MS非靶向方法研究绝经前妇女肥胖与PCOS相互作用的结果

 

作者发现PCOS与肥胖之间存在显著的相互作用，血浆中3种代谢产物的丰度也受到肥胖的影响（乳酸、甘油和油酸）。三种代谢物，己二酸、亚油酸和甘油酸，都受到肥胖和多囊卵巢综合征之间相互作用的影响，但对这些自变量中的任何一个都没有总体显著影响（图2，表2）。6种代谢产物显示多囊卵巢综合征与肥胖之间存在显著的相互作用，其中甘油、己二酸、亚油酸和甘油酸在非肥胖多囊卵巢综合征患者中减少，而在肥胖多囊卵巢综合征患者中增加（图2）。考虑到多囊卵巢综合征患者和对照组的整体情况，与肥胖妇女相比，非肥胖妇女的乳酸含量增加，但这种差异是由非肥胖多囊卵巢综合征患者的增加引起的（图2）。相反，肥胖妇女的油酸含量在考虑到多囊卵巢综合征患者和对照组的整体情况下与非肥胖妇女相比有所增加，但与非肥胖和肥胖对照组相比，非肥胖多囊卵巢综合征患者的油酸含量降低，肥胖多囊卵巢综合征患者的油酸含量增加（图2）。
 

图2 | 代谢产物显示PCOS与肥胖之间存在统计学意义上的相互作用

 

最后，对20例多囊卵巢综合征患者和20例对照者的血浆样本进行了GS-MS靶向代谢组学验证，证实了肥胖对棕榈油酸的影响（P=0.0022），亚油酸（P=0.0001），油酸（P=0.0007）。另一方面，肥胖症与多囊卵巢综合征对己二酸和油酸的相互作用未被本研究所证实，即使样本量减少一半这些相互作用也接近达到统计学意义（P=0.055）。

 

 

实验结论
 

通过GC-MS非靶向代谢组学研究发现：PCOS的大量代谢异质性，主要受其与肥胖症的关系调节。在肥胖的PCOS患者中发现血浆长链脂肪酸（例如亚油酸和油酸以及甘油）的增加，以及肥胖妇女中与PCOS无关的油酸和棕榈油酸的增加，表明脂肪降解增加可能是继发的损害胰岛素对脂肪组织的作用。循环中游离脂肪酸的增加可能进一步促进与肥胖症和PCOS相关的胰岛素抵抗，以及与代谢综合征和非酒精性脂肪肝疾病相关的PCOS和肥胖症。

 

 

小鹿推荐
 

在本次研究中首先在临床和激素特征方面研究多囊卵巢综合征与肥胖之间的作用，再运用GC-MS非靶向代谢组学技术在小分子方面进一步鉴定肥胖对多囊卵巢综合征代谢异质性的影响，最后通过GC-MS靶向代谢组学技术验证实验结论，十分值得借鉴。

 

文末看点
 

代谢组学提供了最能预测表型的数据，其中鹿明生物GC-MS非靶向代谢组学研究以极速周期19个工作日，专利受理数据库含2543个代谢物、精准定性200-500个代谢物。14种内标与QC双重质控，协助客户发表多篇高质量组学文章，活动时间2020.3.09-2020.5.15，具体详情请戳【客户文章】7篇文章，6本期刊，平均影响因子：9.1，助力GC-MS非靶向代谢组学研究

 

 

部分文献参考
 

1. Asuncion M, Calvo RM, San Millan JL, Sancho J, Avila S, Escobar-Morreale HF. A prospective study of the prevalence of the polycystic ovary syndrome in unselected Caucasian women from Spain. J Clin Endocrinol Metab 2000;85: 2434 – 8.

2. Escobar-Morreale HF, San Millan JL. Abdominal adiposity and the polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab 2007;18:266 –72.

3. Azziz R, Carmina E, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, Escobar-Morreale HF, Futterweit W, et al. The Androgen Excess and PCOS Society criteria for the polycystic ovary syndrome: the complete task force report. Fertil Steril 2009;91: 456 – 88.

4. Ehrmann D, Barnes R, Rosenfield R, Cavaghan M, Imperial J. Prevalence of impaired glucose tolerance and diabetes in women with polycystic ovary syndrome. Diabetes Care 1999;22: 141– 6.

5. Luque-Ramirez M, Alpanes M, Escobar-Morreale HF. The determinants of insulin sensitivity, betacell function, and glucose tolerance are different in patients with polycystic ovary syndrome than in women who do not have hyperandrogenism. Fertil Steril 2010;94:2214 –21.

 

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