项目文章 | 华中农业大学徐芳森课题组解析水稻喜铵不喜硝的生理机制

前言 

铵态氮（NH⁺⁴-N）和硝态氮（NO^-3-N）是植物氮营养的两种主要形态，水稻是典型的喜氨作物，但其中涉及的生理和分子机制并不清楚。本文为鹿明生物合作客户华中农业大学资源与环境学院徐芳森教授课题组（该论文的第一作者是博士研究生陈海飞）在《Plant Cell & Environment》发表的题为“H₂O₂ mediates nitrate-induced iron chlorosis by regulating iron homeostasis in rice”的研究论文。该论文运用转录组和代谢组学联合分析方法研究发现水稻喜铵不喜硝决定于根际pH，水稻吸收硝根释放OH^-使根际碱化，诱发根表堆积大量的难溶性铁膜，导致水稻缺铁而抑制生长，在这过程中根际高pH引发积累的H₂O₂调控了根表铁膜的形成与利用。

 

 

中文标题：H₂O₂通过调节水稻体内铁的稳态来介导硝酸盐诱导的铁萎黄病

样本：水稻

发表期刊：PLANT CELL AND ENVIRONMENT

影响因子：5.624

合作单位：华中农业大学

技术手段：RNA-seq分析、LC-MS非靶向代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）

 

 

研究背景

 

铵态氮（NH⁺⁴-N）和硝态氮（NO^-3-N）是植物氮营养的两种主要形态，水稻是典型的喜氨作物，但其中涉及的生理和分子机制并不清楚。该论文研究发现水稻喜铵不喜硝决定于根际pH，水稻吸收硝根释放OH- 使根际碱化，诱发根表堆积大量的难溶性铁膜，导致水稻缺铁而抑制生长，在这过程中根际高pH引发积累的H₂O₂调控了根表铁膜的形成与利用。

 

研究思路

 

 

 

实验结果

 

1.氮形态对水稻生长的影响取决于外部pH值

对不同pH值（5.5， 7.5）和不同氮源（硝酸盐N，铵盐A）水培条件下的水稻生长情况进行实验。发现水稻生长对铵的偏爱取决于外部的pH值。同时，高pH值（pH7.5）培养时，植株根系表面出现大量铁斑，新叶萎黄，经检测新叶中铁含量降低。研究发现硝态氮为唯一氮源时根际pH上升碱化，水稻生长受抑制，表现为新生叶黄化，根系褐色，但只要控制硝态氮营养液pH为酸性（5.5）时，这种抑制现象消失，水稻生长与供铵条件一致，说明水稻对氮形态的选择与根际pH密切相关。

 

图1 | 不同形态和pH条件下水稻的表型特征

pH为5.5下，在铵和硝酸盐（NH₄NO₃）的混合物中水培15d，在初始pH值为5.5时，向部分植物供应铵（A）或硝酸盐（N），培养7d的生长情况；

（a）整株；（b）新叶；（c）根系；A：铵盐，N：硝酸盐

（d）新叶SPAD值和（e）干重；数值为平均值±标准差（n=6株）。

其他植物供应铵（A）或硝酸盐（N）在恒定的pH（5.5：A5.5，N5.5；7.5：A7.5，N7.5）条件下培养，培养7d的生长情况

（f）叶片失绿；（g）叶片铁浓度（n=3个叶片样品，每个样品取自6株植物）；（h）根褐变，（i）铁沉积和（j）锰沉积（n=3个根）

 

叶片萎黄病是高度依赖外部pH值,萎黄病随着外部pH值的增加而增加。元素分析表明,在pH值为7和8时，叶片中的铁和锰浓度严重降低,而其他元素，如N、P、K等浓度无明显变化。
 

图2 | 水稻缺铁失绿症由高PH值诱导的植株

在pH值为5.5的铵和硝酸盐的全强度混合物中生长15d。然后，将植株置于pH 6、7和8的培养基中培养7d。

（a）测定叶片颜色和（b）SPAD值；（c）铁，（d）锰的营养元素浓度

 

2.高pH使得根系中铁缺乏应答基因被强烈诱导

采用RNA测序(RNA-seq)技术进行了转录分析，评价高pH对水稻铁吸收系统的影响。在pH8条件下，水稻根系吸收Fe(II)和Fe(III)的各个步骤中涉及到的大量基因被上调(表1)，这与缺铁反应是一致的。

     

表1 |高pH根系铁稳态的上调基因

 

3.NADPH氧化酶产生的H₂O₂通过改变苯(ben) 丙(bing)代谢来调节铁膜

高根际pH诱导表皮产生过量的过氧化氢(H₂O₂)，这是由于编码NADPH氧化酶Rboh1基因的表达增加，增强了根际的氧化能力，改善了根际铁斑块的形成。而高浓度的H₂O₂通过增加木质素的生物合成，降低酚类物质的分泌来调节苯(ben) 丙(bing)的代谢，从而阻碍了质外体对Fe的动员效率。

图3 | NADPH氧化酶抑制剂和H₂O₂清除剂对铁斑形成和木质素生物合成的影响

（a）pH值为7.5时，5μM DPI作用3d后形成铁斑。

（b）50μM碘化钾在pH 7.5下作用3d或200μM过氧化氢在pH 5.5下作用3d后形成铁斑。

（c）木质素生物合成与NADPH氧化酶抑制剂和（d）H₂O₂清除剂处理3d。

（e）新生叶及（f）SPAD值。

（g）在3, 3’-二氨基联(lian) 苯(ben)胺（DAB）和（h）H₂O₂存在下，棕褐色沉淀显示过氧化物酶（PRX）活性，用不同方法处理1天后，用化学方法定量测定过氧化物酶（Prx）活性。

 

4.活性氧和过氧化物酶对不同的pH值的不同反应

实验表明在水稻根的氧化应激反应中H₂O₂的作用大于活性氧，且H₂O₂浓度和过氧化物酶(Prx)活性受高pH值的显著影响，而不受氮形态的影响。
 

图4 | 过氧化氢（H₂O₂）和愈创木酚过氧化物酶（PRX）在不同N型和pH处理下的活性

（a）处理1天，用3，3'-二氨基联(lian)苯(ben)胺（DAB）染色，观察H₂O₂的变化。

（b） 根中过氧化氢浓度和（c）Prx活性。

 

转录谱分析，83个type III过氧化物酶(Prx)基因在不同的pH（4,6,8）水平下有显著的表达改变。选取其中39个fc > 2的基因进行热图分析，发现高pH诱导Prx表达。
 

图5 | 活性氧及其清除水稻活性氧的酶

（g）Class III-peroxidase (Prx)基因的转录水平评估。

（h）不同pH处理24H时，ph4和ph8(H)诱导>2倍的Prx基因数量。

（i）水稻Prx基因共表达网络分析。循环节点代表基因，节点的大小代表节点间相互关系的强弱。

（j） 定量RT-PCR检测Prx基因的表达。

 

5.外界pH对酚类化合物的分泌及苯(ben)丙(bing)代谢的影响

不同pH水平下根系的LC-MS非靶向代谢组学结果显示，pH为8时，根中酚类物质如甲醚酮、肉桂酸、咖啡酸、原儿茶酸等含量明显降低（图6左）。

作者通过转录谱分析了在不同的外部pH水平下参与苯(ben) 丙(bing)途径基因表达（图6右）。在pH值为4时，介导类苯(ben) 丙(bing)素进入木质素合成(转化为松柏醛)的酶的编码基因被下调，但这些基因在pH值为8时上调。同时组织学染色结果显示，高的外部pH值促进了木质素的形成，在pH值为8的条件下，木质素浓度在12h后显著升高。
 

图6 |不同pH条件下水稻根系中的酚类物质含量及不同pH条件下苯 丙(bing) 酸途径的变化

在pH 4、pH 6和pH 8的水培条件下，植株生长24小时后，用3个生物复制体分别采集根进行RNA序列分析。

（a） 在pH 4和pH 8与pH 6相比变化大于2倍的基因热图分析。

（b） pH 4和（c）pH 8条件下苯(ben) 丙(bing) 酸途径基因改变示意图。红色上调，绿色下调。

 

 

实验结论 

本论文研究发现硝态氮为唯一氮源时根际pH上升碱化，水稻生长受抑制，表现为新生叶黄化，根系褐色，但只要控制硝态氮营养液pH为酸性（5.5）时，这种抑制现象消失，水稻生长与供铵条件一致，说明水稻对氮形态的选择与根际pH密切相关。高pH条件下水稻根系褐色为根表大量的铁锰氧化物沉积所致，由此导致黄化叶片缺铁，并伴随着缺铁特异诱导的基因表达显著上升，外源喷施活性铁后黄化叶片缓解，说明高pH导致水稻叶片黄化为铁缺乏所致。

研究发现H₂O₂参与了这个过程中，根际高pH下NADPH氧化酶活性显著提高，根系活性氧H₂O₂累积，介导了根系通气组织的形成，进而提高了根际氧化力，并诱导根系过氧化物酶的活性，催化H₂O₂与二价铁反应，促进根系表面形成铁膜和堆积。

 

进一步研究发现，高pH下根系苯(ben) 丙(bing) 烷代谢途径中活化根际质外体铁的酚酸类物质含量显著降低，而合成木质素的酚类物质含量增加。外源物质施加试验证明，在pH 5.5条件下外源添加H₂O₂时根系表面出现铁膜沉积，地上部新生叶出现类似于高pH条件下的黄化表型；而在高pH条件下添加H₂O₂清除剂时水稻根系表面铁膜的形成受到抑制，地上部新生叶的黄化症状也得到缓解，外源添加NADPH氧化酶抑制剂显著抑制根表铁膜的形成，同时根组织木质素生物合成受到抑制。

综上所述，高pH诱导积累的H₂O₂介导了根系中苯(ben) 丙(bing) 烷代谢的调控，改变了酚类物质的组成，降低了根系质外体铁活化的能力，导致根表形成铁膜而使水稻叶片缺铁黄化，生长受阻。

 

 

部分文献参考 

1. Haifei Chen, Quan Zhang,etal. H2O2 mediates nitrate-inducediron chlorosis by regulating iron homeostasis in rice[J]. Plant Cell Environ.,2018Apr;41(4):767-781.

 

 

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