开年客户文章解读 |Microbiome（IF=10.465）运用GC-MS非靶标代谢组学研究植物根际微生物对开花时间的影响

编者按
 

新冠抗“疫”不断，科研脚步不停歇

我们在做好自身防护，抗击疫情的同时。作为科研人，在科研路上的脚步却未停歇。本期小鹿带来新年解读客户文章，运用GC-MS非靶标代谢组学和转录组学，揭示拟南芥根部微生物将色氨酸转化为植物激素吲哚乙酸从而延迟开花的代谢调控网络和作用机制。
 

前言

气候变化改变了植物物候学。这对生物圈和地球系统具有重要的生物、物理和化学影响。这些物候变化已成为生态学和环境科学的一个重要课题。本篇为鹿明生物合作客户浙江工业大学环境学院陆涛博士团队在一区期刊Microbiome（IF=10.465）发表的 “植物根际微生物对开花时间影响”的文章，通过整合GC-MS非靶标代谢组学和转录组测序数据，发现根际微生物群对植物关键功能的调控发挥重要作用，揭示了拟南芥根部微生物将色氨酸转化为植物激素吲哚乙酸从而延迟开花的代谢调控网络和作用机制。
 

英文标题：Rhizosphere microorganisms can influence the timing of plant flowering

中文标题：植物根际微生物对开花时间影响的研究

材料：野生型和突变型拟南芥根系分泌物、根际土壤

影响因子：10.465

发表期刊：Microbiome

主要运用技术: GC-MS非靶标代谢组（鹿明生物提供技术支持）、16S rRNA基因测序  

研究背景
 

近年10年的研究表明，植物根际微生物群在植物的生长和繁殖中起着至关重要的作用。根际微生物群可以抵御病原体，通过产生植物激素来改善生长，并可以帮助植物抵御环境干扰，还可促进表型变化。

但是对植物微生物群、根系分泌物以及植物生长与繁殖之间的相互作用的理解仍然很有限。根系分泌物占光合固碳总量的5-21％，有助于促进形成植物根际微生物群落；也可能包含信号传导和化学吸引分子，这些分子会吸引有益微生物聚集，有助于增强病原体抗性、蓄水性和促进生长激素的合成，并影响植物表型。

作者通过研究根系分泌物、土壤微生物和植物生理之间的相互关系，发现它们之间的相互作用具有影响根际群落动态变化的能力，并通过复杂的反馈机制改变植物表型的潜力。

研究思路

研究方法
 

1. 实验材料准备及分组

从种子开始培养两周的野生型Col-0（Wt）和pgr5突变体（光系统突变体）拟南芥幼苗，移植到混合土壤中进行盆栽种植，土壤来自浙江工业大学。种植条件为25±0.5℃、80％相对湿度、冷白色荧光灯（300μmol光子/ m2 / s）和光暗周期12：12-h。在花芽为1±0.1厘米时收集根际土壤，进行微生物代际实验（共三代，图1a），并记录时间和生理参数。

2.检测方法

（1）土壤微生物16S rRNA基因测序

（2）实时定量PCR（qRT-PCR）分析根际DNA丰度

（3）土壤样品溶解相的测量

（4）根系分泌物GC-MS代谢组分析

（5）添加色氨酸（Trp）、5-羟色氨酸（5-HTP）和吲哚乙酸（IAA）并进行开花前后相关的基因转录组测序分析。

实验结果和讨论
 

1.根际微生物可延迟野生型拟南芥的开花时间

多代适应性/驯化实验可用于观察微生物介导的植物生长和繁殖机制。本实验发现第3代Wt-M根际微生物群可显著影响拟南芥开花和繁殖，G3-Wt-M组的开花时间明显延迟了大约3天，并且角果数量显著增加。但根际微生物的丰富度和多样性随着变化而趋于下降。与第1代根际相比，第2代和第3代微生物菌群中Proteobacteria和Acidobacteria相对丰度降低，而杆菌和蓝细菌丰度有所提高（图1c）。实验结果表明，某些早（或晚）开花植物可能与特定的土壤微生物家族有关，而植物微生物群可能与不同植物生长阶段的变化有关。本实验中三代选择富集的微生物在植物开花时间的调节起关键作用。
 

图1 |跨代微生物实验设计和根际微生物群落概况

（a）植物选择土壤微生物的实验操作图；

（b）根际微生物丰富度：ACE指数和每个样品的物种数；

（c）三代拟南芥中最丰富的10种微生物门的相对丰度。G-Wt-M代表相应野生型世代中的微生物群；G-pgr5-M代表相应世代pgr5拟南芥中的微生物群。

2.根际微生物可延迟pgr5突变体拟南芥的开花时间

为了更好地了解微生物群，分泌物和开花时间之间的关系，作者使用了拟南芥突变体（PGR5基因）植株，pgr5突变体具有光合作用的缺陷，根际分泌物与野生型有所不同。微生物群处理组中的pgr5突变体，与对照组（不添加土壤微生物群）相比，在第3代微生物群的开花时间提前将近4天，并且角果数显着降低。因为pgr5-M和Wt-M处理组的香农多样性和丰富度指数在三代中一般没有差异，但是ACE数据在一代之后有所不同（图1b）；在每个世代的两个拟南芥品系之间，门的相对丰度仅略有不同（图1c）。因此作者推断由微生物引起的植物繁殖变化可能不是由根际多样性导致的。

3.稀有根际微生物可能影响拟南芥的开花时间

第三代Wt培养的微生物群（WM）和第三代pgr5培养的微生物群（PM）处理组之间的丰度差异较大，WM和PM处理共有77个根际属的相对丰度差异显著。有41个属在WM处理组中富集，而PM处理则有36个属富集。大多数富集的根际微生物是稀有的（相对丰度<1％），表明稀有的根际微生物可能在拟南芥开花中起调节作用。
 

图2 | 第三代微生物功能的验证

野生型（Wt）和两个突变体开始开花的天数（a，c）、新芽重（b，d）。

第三代未灭菌土壤泥浆（WM和PM）（a，b）或无菌土壤泥浆（WM-S和PM-S）（c，d）生长的拟南芥。

WM-第3代微生物菌群生长的野生型拟南芥；

PM-第3代微生物菌群生长的pgr5突变体拟南芥；

WM-S无菌土壤生长的野生型拟南芥；

PM-S无菌土壤泥浆生长的pgr5突变体拟南芥。

野生型和两个突变株系（pnsB4和pgr5）拟南芥的土壤样品中涉及氮循环基因的相对丰度（e: amoA，氨氧化;

 f: nifH，氮固定; g: nirK，亚硝酸还原酶; h: nosZ，一氧化二氮还原酶）

4.微生物功能的验证

在Wt、pnsB4和pgr5突变体植株中，添加Wt菌群使开花分别延迟3.3、5.5和5.7天（图2a）。与添加pgr5菌群相比，用Wt菌群处理的三个品系中植物的苗鲜重也显著增加（图2b）。这些结果清楚地表明开花时间可能受到根际菌群的影响。但在接种前对土壤浆液进行灭菌时，这种作用也消失了，表明仅有根系分泌物并不能调节拟南芥的开花时间（图2c，d）。有趣的是WM和WM-S（灭菌土壤泥浆）处理过的植物之间的差异不是很明显。原因可能是灭菌土壤浆中含有更多的氮和其他养分来影响开花时间，这与图3中的结果一致。因此作者推测灭菌浆液中的代谢产物也影响开花时间和植物形态。多个证据表明，在pgr5处理组中通过根际微生物群调节氮循环和生物利用度导致氮缺乏，从而诱导较早开花。低浓度硝酸盐可以诱发开花，但是在氮充足时，在开花前植物生长量最大。

图3 |  N可用性可能会受到第三代微生物群的影响

三个拟南芥品系在WM和PM处理组接种后（n = 12），（A）N含量（NH4+）；

（B）脲酶活性；

（C）N含量（NO3-）和（D）硝酸还原酶活性。

不同的字母代表显著差异（p <0.05）。

 红色符号代表经WM处理的样品，蓝色符号代表经PM处理的样品。

5.两个拟南芥品系中不同的根系分泌物

根系分泌物可以作为影响微生物组成的关键底物或信号分子，作者进行了品系之间不同浓度和组成分泌物的检验。GC-MS非靶向代谢组学分析发现，两条株系（Wt和pgr5）共有34种差异分泌物，涉及10条代谢途径（图4）。相对于pgr5，Wt中有4条条代谢途径上调（图4b）。胸腺嘧啶是差异最大的代谢物，可被细菌降解，可能是WM组中NH4+含量增加的原因（图3A）。Wt培养物中氨基酸的浓度通常较高，可能与Wt培养物中枯草芽孢杆菌的丰度较高有关，其中氨基酸是趋化因子。在Wt培养物中色氨酸及其衍生物、酚和一些羧酸渗出量较高。与假说不同，这些代谢组学结果表明渗出液会影响根际微生物群。
 

图4 | 两种拟南芥株系的根系分泌物

（a）Wt和pgr5处理组根系分泌物（n = 6）的PCA得分图；

（b）Wt和pgr5处理差异分泌物的相应代谢途径（p <0.05）；

（c）第三代拟南芥Wt或pgr5突变体培养物土壤的色氨酸（Trp）和吲哚-3-乙酸（IAA）含量；

（d）预先在Wt拟南芥土壤培养并被添加到Wt（WM）或pgr5突变体（PM）拟南芥的微生物群中的Trp和IAA含量。

6.IAA通过下调开花相关基因来延迟开花时间

生长素以多种方式调节植物的生长，IAA是一种重要的植物生长素，具有调节花诱导信号的作用。微生物可以从Trp合成IAA，本实验发现的根际富集微生物之一节杆菌具有产生IAA的能力，对植物生长有益。Wt分泌物中富含Trp及其衍生物，因此微生物产生的IAA可以通过新的分子网络控制开花时间。土壤中Wt培养物产生的Trp含量降低，而IAA含量增加3.03倍，表明Wt菌群将Trp迅速转化为IAA（图4c，d）。作者通过向水培培养物中添加Trp、5-羟基色氨酸（5-HTP）和IAA并通过监测开花时间来探索微生物产生IAA延迟开花时间的可能性，实验表明IAA是延迟开花时间的直接驱动力。开花相关基因表达的变化进一步验证了IAA在调节开花时间中的作用（图5b）。

有文献报道IAA减轻了天冬氨酸对花粉生长的抑制作用，因此推测IAA促进了拟南芥的生殖生长。本文进行的代际研究不仅证明IAA是延缓拟南芥开花的重要信号还第一次提出相关机制。早期的文献研究表明，IAA可刺激花器官的发育，但延迟了拟南芥的开花时间。本文数据强烈表明IAA在没有氮限制生长的情况下可延迟开花并充当了最佳生长条件的信号。
 

图5 | IAA通过下调开花相关基因延迟开花时间

（a）抽薹比例；

（b）一代培养后，在开花早期、中期和后期拟南芥开花相关基因转录的相对速率（植物在含有5nM和25nM IAA的MS培养基中生长）。

研究结论
 

了解根际微生物的群落/功能关系以及与植物生理学相互作用对确定植物微生物组在调节生物地球化学循环、植物生长和物候学中的作用至关重要（图6）。作者确定了一个新的代谢网络，发现分泌物影响植物的根际微生物群，然后通过产生IAA来调节开花时间，还可通过调节氮利用来影响营养生长。IAA促进植物生长也进一步刺激分泌物渗出，并因此以积极的反馈机制影响开花时间。
 

图6 | 植物与根际微生物群之间相互作用的示意图

假设的根际微生物群落-功能关系以及通过根系分泌物、氮循环和产生植物激素IAA与植物生理学和花卉物候学的相互作用

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植物信号分子是研究热点之一，但信号分子作用机制的阐述和根部微生物关系的研究却并不多见。本文深入研究植物代谢机制，提出了新的代谢调控网络，实验设计和研究思路值得借鉴。
 

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部分文献参考

1. Penuelas J, Filella I. Phenology. Responses to a warming world. Science. 2001;294:793–5.

2. Fitter AH, Fitter RSR. Rapid changes in flowering time in British plants. Science. 2002; 296:1689–91.

3. Penuelas J, Rutishauser T, Filella I. Phenology feedbacks on climate change. Science. 2009; 324:887–8.

4. Menzel A, Sparks TH, Estrella N, Koch E, Aasa A, Ahas R, et al. European phenological response to climate change matches the warming pattern. Glob Chang Biol. 2006; 12:1969–76.

5. Hinsinger P, Bengough AG, Vetterlein D, Young IM. Rhizosphere: biophysics, biogeochemistry and ecological relevance. Plant Soil. 2009; 321:117–52.