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前言

数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。DIA 是一种靶向蛋白质组学技术，其对选定质荷比（m/z）范围内的所有离子进行碎裂和二级质谱分析。

DIA 是数据依赖性采集（Data-dependent acquisition, DDA）的替代方案，DIA 相比于 DDA 的最大的优势在于高效测定复杂样品中丰度极低的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度有更高的定量准确性和可重复性。


图：DIA 与 DDA 对比

应用案例解析

结合样本制备技术及数据非依赖性质谱技术高通量鉴定血清蛋白质

材料：血清
主要技术：DIA 技术
期刊：J. Proteomics
影响因子：3.722

文章摘要：
血清的高度复杂性和动态范围使得基于质谱的血清蛋白质组极具挑战，而血清生物标志物研究迫切需要高通量、高准确性的血清蛋白质组学方法。

本研究建立了简化的血清蛋白质组鉴定流程，可从 1μL 血清中快速准确地进行蛋白质组学分析。该工作流程结合了高灵敏度和可重复的样品制备技术和 DIA 技术。与 DDA 相比，优化的 DIA 方法使检测到的肽和蛋白质的数量翻倍，且具有更好的重现性，无需免疫富集和预分馏，单次 DIA 分析可在 50 分钟梯度时间内定量 300 多种蛋白质。这些蛋白质丰度跨越五个数量级，且包含 50 多种 FDA 批准的疾病标记物。此工作流程每天可分析 20 份血清样本，平均每个样本可鉴定出约 358 种蛋白质。本研究用此流程对肾细胞癌（RCC）血清样本进行分析并鉴定相关生物标志物。

方法流程






数据较高的重复性

小鹿点评

这是一篇标准 DIA 分析流程的文章。通过多次 DDA 鉴定（多个馏分或多次重复）建立较为全面的参考库，之后对血清样本进行制备和 DIA 鉴定，结合参考库对 DIA 数据进行分析。本文为建立快速高效的血清蛋白质组学方法，在样本制备上没有进行常规的血清去高丰度蛋白或分馏分，而是直接对血清样本进行酶切及随后的 DIA 鉴定，平均可鉴定到 300 多种蛋白质，数量上远超过常规 DDA 模式，体现了 DIA 技术在蛋白质鉴定数及定量准确度上的优势。

小鹿答疑

Q1. DIA 技术和 PRM 技术可否共用数据库？
回复：理论上如果是同一个样本、共用同一个库的话是可以的，但前提是实验要在同一台质谱仪上进行，且时间间隔较短。

Q2. 如果样品中有高丰度蛋白是否需要去除？
回复：碰到有高丰度蛋白的样品，需要去除高丰度蛋白，费用也单独收取。

Q3. DIA 技术适用什么样的样品？
回复：所有的样品都可以做，只要蛋白的量满足要求。

小鹿百科

DIA 原理

液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）相结合的技术成为蛋白质组研究的主要研究手段。在自下而上的蛋白质组学中，蛋白质通过蛋白水解酶消化成肽段，这些肽段通过高效液相分离后经电喷雾电离源（ESI）加上电荷，发射到质谱仪中进行一级质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）的分析。一级质谱由肽段离子的质荷比和信号强度组成，二级质谱由肽段碎裂后的碎片离子质荷比和信号强度组成。
DDA 为数据依赖性采集方式，选择一级质谱中特定数量的肽段分子（如信号强度最强的前 10 个离子）进行高能碰撞碎裂，产生的碎片离子送入二级质谱检测。

DIA 为数据非依赖性采集方式，随着时间连续设置一定范围的质荷比窗口，对将通过窗口的全部肽段离子进行碎裂并用二级质谱检测碎片离子的信号。相比之下，DIA 模式不涉及到对肽段离子的限制性筛选，定量准确性和重复性都要优于 DDA 模式。但 DIA 模式产生的碎片离子谱图过于复杂，丢失了肽段及碎片离子的对应关系，对其结果的解析较为困难。目前的方法是通过建立样本的参考库（如同一样本的 DDA 数据），对 DIA 的混合数据进行去卷积分析来鉴定和定量肽段。
 

图. DDA 和 DIA 原理
 
DIA 优势及技术难点

DDA 模式对肽段离子的选择具有限制性和随机性，存在较多的数据信息缺失，而 DIA 模式的目标则是获得完整的数据，实现蛋白质的深度覆盖和精准定量。此外在复杂样品中，二级信号的定量比一级信号更为灵敏（例如一级质谱信号可能存在相似质荷比离子的干扰）。DDA 模式为一级质谱信号定量，而 DIA 模式为二级质谱信号定量，因此 DIA 模式的定量准确性和重现性都更好。

DDA 模式下肽段分子和其二级碎片离子有着对应关系，通过对已知数据库的搜索匹配，即可得到样本中的肽段及相关蛋白质信息。而 DIA 模式下肽段离子与其碎片离子之间的直接关系丢失（DIA 光谱中的碎片离子可能是由多个肽段离子），复杂的谱图仍然给后续的数据分析和统计学检验带来很多挑战。对此目前已有多个团队开发出 DIA 分析的软件，例如 OpenSWATH 和 Skyline，这些软件通过建立样本的参考库，对色谱峰进行抽提并分析。此外也有研发团队提出不需要参考库的数据分析方法 DIA-Umpire，通过对肽段离子和碎片离子的匹配合成产生虚拟谱图进而搜库分析。因此，DIA 技术非常适合一次性获取数百上千种蛋白质更为全面信息（高覆盖率，高准确度，高重复性）的研究。

上海鹿明生物科技有限公司，作为 DIA 服务提供者，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过不断地完善发展，公司建立起了 Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、L-WB、MPI、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台和相应的数据整合分析平台。迄今为止，鹿明完成服务项目上万个，涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域，协助合作伙伴在 Nature Genetics，Nature Communications，Mol Cell Proteomics 等期刊发表 SCI 论文数百篇。

文献来源

Lin L. et al., High throughput and accurate serum proteome profiling by integrated sample preparation technology and single-run data independent mass spectrometry. 2018, J Proteomics.

注：11 月 2 日-5 日，由中国植物学会与亚太农业蛋白质组学组织（AOAPO) 主办，济南大学承办的第七届全国植物蛋白质科学大会暨第五届亚太农业蛋白质组学会议将在济南市召开，欢迎大家参与。