DIA上机干货 | 如何计算并设置可变窗口参数？

前言

数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。小鹿今天就跟你聊一聊DIA技术中重要部分:DIA数据采集窗口该如何设置呢？

固定窗口

图1 | 固定窗口采集示意图

假设500m/z到900m/z的扫描范围，分成四十个窗口，那么每个小窗口固定的是10m/z，纵坐标为保留时间，固定的保留时间扫描固定质荷比的离子，一一对应的关系，那么整个梯度下来，就能涵盖整个所有质荷比范围内的离子。但是固定窗口扫描方式存在的局限性是：质荷比分布不均匀，有的窗口比较密，有的窗口比较疏。因此，出于对谱图质量以及质谱的负荷考虑，选择可变窗口模式比固定窗口模式更合适。

可变窗口

可变窗口根据m/z分布密度计算合理的窗口宽度和数量，以保证质谱的采集既不会很饱和，也不会很空。

图2 | 子离子峰采集的点的要求

01.在进行DIA可变窗口的设置时我们首先要计算可变窗口的数目。设置可变窗口的数目应保证定量准确，而定量准确的前提为：对每个子离子的峰能够采集到足够多的点（一般大于10个点，最少8个点）。

图3 | DDA谱图

观察DDA谱图，并将DDA谱图分为前，中，末三段，得出平均峰宽假设为30s。

图4 | 可变窗口计算的方法

假设可变窗口数目为(N),每个窗口谱图采集时间(T)以及峰宽(Tw)，计算可变窗口的方法如上图4。

02.在AB SCIEX公司下载的EXCEL文件表格中设置参数，设定好EXCEL下图窗口的参数如，总窗口数（第一步计算得出），扫描质荷比范围（DDA数据得出）以及CES (碰撞能量变化)等参数。

图5 | EXCEL表格参数设定

图6 | DDA m/z范围以及强度分布表

把DDA数据导出的m/z范围以及强度分布表格（如图6）导入到下载好的Excel公式中，按“F9”自动开始计算，得到如图7的可变窗口分布图，和图8可变窗口结果表格。

图7 | 可变窗口分布图

图7中蓝色的线表示不同质荷比离子的密度分布情况；红色线表示动态窗口的计算结果。可以看出，离子密度越多的质荷比范围内，其相应设置的窗口宽度越窄，反之，离子密度较小的m/z范围内，窗口便会较宽。因此实现质谱扫描的均匀性和准确性。

图8 | 导出的可变窗口的结果

如图8，前两列为扫描窗口的范围，为防止质量轴偏移导致扫描缺失，设置了1 m/z的overlap。在编辑质谱上机方法时，将窗口范围直接粘贴上去即可。

关于鹿明

上海鹿明生物科技有限公司（前身：上海博苑生物科技有限公司）成立于2009年，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近10年的发展沉淀，公司建立起了Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

迄今为止，鹿明完成服务项目上万个，涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域，发表SCI论文数百篇。2017年6月，公司与上海欧易生物医学科技有限公司实现战略整合，实现中心法则上中下游多层组学的串联，整合后的鹿明力求打造一流技术平台，争做一流蛋白代谢服务企业，助力生命科学领域的科学家快出成果，出好成果，从而推动科技创新。

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