知识干货 | PRM对不同癌症细胞系中酪氨酸激酶的相对定量分析

基本信息

文章标题：

Quantitative Profiling of Protein Tyrosine Kinases in Human Cancer Cell Lines by Multiplexed Parallel Reaction Monitoring Assays

PRM对不同癌症细胞系中酪氨酸激酶的相对定量分析

期刊：MCP

发表日期：2016

IF：5.232

研究对象&意义：PTK

蛋白酪氨酸激酶（PTK）在细胞信号转到细胞周期调控、分裂、分化等方面存在举足轻重的作用。PTKs是最受关注的作为抗癌药物靶点的酶超级家族之一，那么对于PTKs蛋白超家族的检测有没有好的方法能够一网打尽，既能全面又能准确，同时对实验室的同学又比较友好的方法呢？答案是有的，这篇文章给大家展示了一个范例。

 技术方法

PRM，磷酸化iTRAQ，WB，RNAseq

实验组：4个study

人基因组内一共存在90个PTKs编码基因，其中58个是受体型蛋白酪氨酸激酶，32个为非受体型酪氨酸激酶。以往的研究表明PTK表达受多种因素的影响，其中主要的有外部诱因的刺激，基因组本身的特征如基因突变、药物抵抗等。本文在实验设计时设置了4个study。分别为：a.增殖与表皮生长因子刺激下的A431细胞的比较；b. SW480Null(APC基因突变)与SW480APC (APC恢复)结肠肿瘤细胞系；c. 基因异质性的10株结直肠癌细胞；d.敏感性肺癌细胞（11-18）与抗药性肺癌细胞（11-18R）。基本涵盖了全部的因素如基因因素、环境因素以及诱导因素造成的PTKs丰度变化。

检测设备&软件

PRM：Easy nLC-1000 pump，Q-Exactive；软件：skyline

RNA-seq：Illumina HiSeq 2000

 技术路线

对人基因组中的90种PTK蛋白作为候选的PRM检测目标，在实验涉及到的4个study分别进行特地蛋白肽段的检测。为评估PRM方法的稳定性，文章中引入了稳定同位素标记的标准肽段，并混入不同study的样本中，每一个样本的PRM结果中对其检测到的数据计算变异系数进行评估。接下来文章在PRM采集大量的PTK数据后（一共83个PTKs，共308条，分别来自54个受体酪氨酸激酶和29非受体型酪氨酸激酶）比较分析了不同方法下的结果是否具有很高的统一性，包括iTRAQ（磷酸化），Western Blot，RNA-seq。iTRAQ（磷酸化）实验设计除了能够对平时常见的iTRAQ和PRM两种技术的结果进行比较外，还对酪氨酸激酶的丰度与活化程度的关联性有一定的揭示作用。

结果展示

• 1、PRM方法评估：

• 三种标记的肽段U-13C6, U-15N4精氨酸标记的alkaline phosphatase (AP) peptide (AAQGDITAPGGA*R),β-galactosidase (BG) peptide(APLDNDIGVSEAT*R),β-actin (ACTB) peptide (GYSFTTTAE*R)在每个样品酶解之后马上混合，并与样本一同后续的处理和检测。在不同的study中每种标准肽段检测结果的变异系数如下：都能控制在10% CV以内（除了一条12.92），稳定性是非常可靠的，即使在不同的样本体系中一样表现的非常突出。

• 2、4个study中PTK运用PRM技术检测到的情况如下：

• 一共83个PTKs，共308条，分别来自54个受体酪氨酸激酶和29非受体型酪氨酸激酶。下图是讲3个study的检测和RNA-seq的结果综合展示（study3文章未展示）。可以发现这些分析表明在检测到的蛋白质之间存在高度的对应关系和PTKs的mRNA，尽管总共有70%的转录本在三种模型都没有被检测为蛋白质。这可能反映了蛋白质含量低或者翻译效率低信使RNA。

Study 1

Study 2

Study 3

Wb：WB的结果图和上面PRM与RNA-seq的展示图一起看，我们可以得出PRM的结果与WB的结果依然重合行非常高。

Study 1

Study 2

Study 3

Study 4

3、磷酸化itraq

• 磷酸化itraq实验首先是通过IP和IMAC富集得到的酪氨酸磷酸化肽段，然后通过4标iTRAQ进行检测，得到的磷酸化肽段和磷酸化蛋白的结果如下截图。一共得到77个磷酸化蛋白，168个酪氨酸磷酸化位点，其中65个位点倍数相差1.5倍以上。这部分实验设计是为了更好地评估PTK丰度变化与PTK激活之间的作用，也是对PRM单纯检测PTK含量的一个补充。

拓 展

PTKs是最受关注的作为抗癌药物靶点的酶超家族之一。PTK的表达在不同类型、不同分期的癌症中存在差异。改变PTK的表达是靶向治疗癌症的重要突破口之一。文中展示的PRM靶向检测及分析方法可能对这方面的研究和应用有非常客观的前景。

文中PTK表达的变化发生在了所有用到的细胞模型系统中，特别在结肠肿瘤细胞系显示了与许多PTK有意想不到的联系，比如 KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA和CTTNB均存在不同的变化。

当然在PRM中未能检测到的PTK，却在mRNA水平发现其表达的事实表明文中提到的方法还有提升的空间，比如选择更合适的肽段或者选择性的富集感兴趣的PTK多肽等方法进一步提高覆盖度和定量的准确性。