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前言

昨天小鹿给大家划了下GCMS的重点，今天给大家带来一篇运用鹿明生物GC-MS代谢组和蛋白iTRAQ技术的客户文章，由南京大学赵丽娟老师发表在EST（Environmental Science & Technology）杂志，下面请看详细解读。

基本信息

文章题目：C60 Fullerols Enhance Copper Toxicity and Alter the Leaf Metabolite and Protein Profile in Cucumber

C60富勒醇对铜协迫黄瓜叶片组织的蛋白及代谢组学研究

材料：黄瓜叶片

主要技术：GC-MS & iTRAQ技术

期刊：Environmental Science & Technology

影响因子：6.6

研究背景

生物胁迫/非生物胁迫都会导致生物体内活性氧的ROS产生，从而影响农作物的产量。至今为止很少有文献报道外源性ROS清除者对这一胁迫作用的影响，本文就从C60富勒醇，这一自由基清除者出发，研究其对铜胁迫作用下黄瓜生长影响的相关机制。

在这项研究中，C60富勒醇被用于三周大的暴露于/不暴露于铜离子（5 mg/株）的黄瓜植株（1或2 mg/株）根部。结果表明，C60富乐醇会增加铜的毒性，它会增加铜离子流入细胞。进一步利用代谢组学和蛋白质组学研究发现，代谢组学显示C60-富乐醇会导致一些抗氧化 代谢产物，包括3种-羟基黄酮、1,2,4-苯三酚和甲基反式肉桂酸酯的上调，而一些细胞膜代谢物（亚麻酸和棕榈油酸）则是下调的。蛋白质组学分析显示，C60-富勒醇作用的植株中叶绿体蛋白的表达是上调的。在水光解（psii蛋白）、采光（cab）、ATP产生（atp合成酶）、色素固定（mg ppix）和电子输运（cyt b6f）等是下调的。叶绿素荧光实验测定表明，C60-富勒醇显著加速了叶绿素的降解和叶片中的电子传输效率，从而诱导黄瓜叶片叶绿体中ROS的过量产生，建议后续在农业生产过程中要谨慎使用C60富勒醇这一类自由基清除剂。

样本制备与结果展示

1、富勒醇相关物理性质及其ROS清除能力

以上描述了C60富勒醇的一些相关理化性质，及其对活性氧的清除能力，综合评价其对活性氧ROS是具有较好的清除作用的。

2、C60富勒烯对铜胁迫下氧化应激反应的影响

在这项研究中，设置了6个组。A:对照组（既不加入富勒醇也不加入铜）；B:加入1mg富勒醇；C:加入2mg富勒醇；D:加入5mg铜；E:加入1mg富勒醇和5mg铜；F:加入2mg富勒醇和5mg铜。从图I中可以看出，铜的加入会引起叶片褪绿及衰老，C60富勒醇的加入会加剧这一衰退现象。图II中可以看出铜存在的条件下，不同浓度C60富勒醇的加入并不会导致丙二醛的含量的差异，从而表明两组之间并没有出现脂质的过氧化，铜暴露组与未暴露组相比，其叶片中丙二醛的含量出现了明显的增加，综合上述现象说明C60富勒醇的加入对铜胁迫条件下丙二醇的产生并不会有太大的影响，从而进一步说明C60富勒醇的加入对铜胁迫并没有改善作用。图III说明C60富勒醇的加入会加剧叶片样本中铜含量的增加。图IV结果表明C60富勒醇有可能导致了叶片细胞膜组成的改变，但并没有破坏叶片的表型，也从侧面说明了C60富勒醇有可能导致植株铜摄入的增加，甚至有可能是通过“富勒醇-铜复合体”的形式进行的。

3、不同组别中黄瓜叶片代谢组学分析

采用GC-MS对不同组样本中黄瓜叶片组织进行代谢组学分析，图I的PCA分析表明加入铜处理样本组与不加入铜处理的样本组是可以明显的区分开来的，说明铜的加入会明显改变叶片组织的代谢物的组成。图II的OPLS-DA分析表明C60富勒醇的加入也会明显改变叶片组织中代谢物的组成。

韦恩图中就体现了不同浓度C60富勒醇处理的铜胁迫情况下不同组别中差异代谢物的结果，表明尽管C60富勒醇的剂量远小于铜的剂量，但是其带来的代谢产物的变化还是非常明显的；如亚油酸、这一细胞膜重要组成部分，在C60富勒醇处理了之后，其含量是会出现明显的下降的，进一步说明C60富勒醇处理会导致细胞膜组成的改变。结合详细的代谢产物的结果，我们认为，脂肪酸的下调、抗氧化剂的上调都能够从侧面反映C60富勒醇有可能触发了某一未知的产生活性氧ROS的机关，而这一现象与之前大家所认为的C60是一种活性氧清除者是相悖的。

4、不同组别中黄瓜叶片蛋白组学分析

ITRAQ蛋白质组学一共是鉴定到了3125个蛋白，加入C60富勒醇处理的植物叶片样本中，有286个差异蛋白，其中有165个蛋白上调、121个蛋白下调（筛选标准FC > 1.2 or < 0.87; p ≤ 0.05）。KEGG通路分析表明，光合作用，CH3COCOOH代谢，碳代谢，柠檬酸循环，碳固定，C2H2O3、二羧酸代谢，糖酵解/糖异生，核糖体、卟啉和叶绿素代谢这些通路是被显著富集了的。PPI蛋白互作网络分析结果表明，有5个蛋白是跟能量代谢明显相关的，且不同表达量的蛋白分别是与光合作用、碳固定、能量代谢及抗胁迫相关的。

5、光合作用相关的蛋白

叶绿体荧光实验数据表明，C60富勒醇是一个非常好的电子受体，可促进叶绿素生物合成及光系统中的电子传输率，从而影响光合过程。

6、能量及碳水化合物代谢

涉及到能量及碳水化合物代谢的蛋白被分为4类，糖酵解途径、戊糖磷酸途径、TCA循环以及其他的途径。C60富勒醇的加入导致样本中GPI、GAPDH的上调，干扰了糖酵解这一途径；SCoAL、MDH等物质的下调，导致TCA循环受到一定的抑制；以上都表明C60富勒醇对能量代谢是有一定的影响的。

同时，ITRAQ分析结果表明，与解毒及抗胁迫相关的蛋白如GST、铁蛋白等，在C60富勒醇处理的样本中是上调的，也从另一方面说明了，C60富勒醇是可以诱导并激活植物的抗氧化反应机制的。

综上，C60富勒醇既可以触发植物中能量代谢的紊乱、产生大量的ROS，又可以通过诱导并激活植物的抗氧化反应机制来中和能量代谢紊乱带来的大量ROS。

差异代谢物在类固醇类激素生物合成、叶酸、花生四烯酸和亚油酸代谢以及初级胆汁酸生物合成途径中均显著富集，雌雄之间的差异主要表现在淀粉和蔗糖代谢以及半乳糖代谢，均在雌性组中显著富集。

环境影响及结论

在此项研究中，C60富勒醇作为一种新型的纳米材料，理论上被认为可以用做外源的抗氧化剂，然而结果表明，C60富勒醇是可以增强铜的毒性的，可以通过增强黄瓜叶片中电子的传递速率从而增加铜进入植物细胞。进一步的研究发现C60富勒醇既可以触发植物中能量代谢的紊乱、产生大量的ROS，又可以通过诱导并激活植物的抗氧化反应机制来中和能量代谢紊乱带来的大量ROS。鉴于以上发现，后续在实际环境应用领域方面可以结合C60富勒醇这一系列的性质来进行持续性的开发及利用。

参考文献
C60 Fullerols Enhance Copper Toxicity and Alter the Leaf Metabolite and Protein Profile in Cucumber. Lijuan Zhao et.al., 2018,. Environmental Science & Technology . IF=6.6.

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