客户文章|扬州大学刘秀梵教授运用TMT定量蛋白质组学鉴定NDV病理的新表现形式

前言 

新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。本篇由上海鹿明生物科技有限公司合作客户扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室刘秀梵教授课题组发表在《Journal of Proteomics》的文章“Quantitative proteomics identify an association between extracellular matrix degradation and immunopathology of genotype VII Newcastle disease virus in the spleen in chickens”运用TMT定量蛋白质组学技术首次提供了NDV对ECM调节的证据，并将ECM重塑作为NDV病理的新表现形式，加深了对NDV发病机制的了解。 

 

基本信息

英文标题：Quantitative proteomics identify an association between extracellular matrix degradation and immunopathology of genotype VII Newcastle disease virus in the spleen in chickens

中文标题：定量蛋白质组学鉴定鸡脾脏中细胞外基质降解与基因型VII新城疫病毒的免疫病理相关

材料：病毒株、细胞系、鸡

发表期刊：Journal of Proteomics

主要技术：TMT、qRT-PCR、Western blot、ELISA

 

 

研究背景

新城疫（Newcastle disease, ND）是家禽最重要的传染病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是其病原体，仅具有一种血清型，而该病毒的基因型多样性和快速进化仍是控制该疾病的挑战。VII型新城疫病毒于1980年代末在远东地区出现，被归类为晚期基因型，是目前许多国家中主要的新城疫基因型。与早期基因型病毒相比，该基因型的发病机制具有明显的脾脏免疫病理学特征。异常的先天免疫反应，有助于脾脏中基因型VII NDV引起的免疫病理。强烈的细胞因子反应被认为与脾脏中基因型VII NDV的高水平病毒复制有关。然而，脾脏中基因型VII NDV的免疫病理机制仍未完全了解。本文作者先前通过转录组学研究发现，与基因型IV病毒相比，基因型VII NDV显着上调了脾脏中先天免疫相关基因的表达。此外基因型VII和IV病毒在调节鸡脾脏中的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）基因方面也有很大差异。两种基因型的病毒使多数ECM基因下调表达，而基因型VII株引起的下调程度更显著。因此，本文旨在从蛋白水平揭示ECM的变化与脾脏基因型VII NDV免疫病理学之间的关系。

  

结果分析

1.鸡基因型VII和IV NDV的病理学

在感染后第3天，所有感染JS5/05(genotype VII)或Herts/33(genotype IV)的鸡都开始表现出抑郁、不愿移动和腹泻等明显的临床症状。感染后第4天，临床症状发展为明显的抑郁，呼吸困难，严重腹泻和麻痹。感染后第5天，所有鸟类都死于感染。对组织学变化评分（图1B）表明，与Herts /33相比，JS5/05引起的脾脏组织学变化更为严重。感染后第3天，Herts/33引起脾脏轻度淋巴样消耗和坏死（图2D）。相反，JS5/05引起广泛的淋巴样耗竭、坏死和明显的坏死碎片（图2E）。此外，在感染后第1天，未检测到JS5/05和Herts/33在脾脏中的复制。但是感染后第3天，脾脏中JS5/05的病毒载量显着高于Herts /33的病毒载量（图1C）。这些数据表明，JS5/05和Herts/33均对鸡具有高度致死性，诱导相似的临床症状和死亡率，而脾脏的病理表现差异较大。

图1 | 脾脏中组织学病变评分和病毒载量测量

                                                                                                                                    图2 | 脾脏中组织学病变评分和病毒载量测量

 

2.脾脏中ECM蛋白的富集

接着作者利用ECM蛋白的不溶性同时消耗其他可溶性细胞成分的顺序脱细胞程序从而从脾脏中富集ECM。作者发现分子量> 180 kDa的条带在最终ECM组分中显著富集，此条带可能表示ECM中胶原蛋白I的交联（图3B）。在不同的ECM馏分中仍观察到GAPDH、组蛋白H3和β-肌动蛋白的污染。但最终ECM富集组分中的GAPDH和β-肌动蛋白大量减少（图3B）。这些结果表明通过建立的脱细胞程序，已成功地从鸡脾中富集ECM蛋白。

图3 | 鸡脾中ECM蛋白的富集

 

3.定量蛋白质组学分析ECM富集结果

为了挖掘ECM在基因型VII NDV病理学中的作用，作者通过TMT标记定量技术系统地表征了感染基因型VII JS5/05或基因型Herts/33的鸡在感染后第1天和第3天脾脏的ECM蛋白质组。共鉴定到5336种蛋白质，其中186种（3.5％）蛋白质与ECM相关（图4A）。在186种鉴定的ECM蛋白中，有120种核心基质（胶原蛋白；ECM糖蛋白；蛋白聚糖）和66种基质相关蛋白（ECM附属蛋白；调节剂；分泌因子）（图4B）。这些结果表明，使用LC-MS/MS技术在富集ECM蛋白的脾脏样品中成功鉴定了不同基质类别的ECM蛋白。

图4 | ECM和非ECM组分的相对分布

 

接着作者比较了显著差异的ECM蛋白。感染后第1天，Herts/33与对照组相比，COL3A1、galectin和LGALS16的丰度增加了约2倍。而与对照相比，JS5/05感染组中MMRN1、COL1A1和COL1A2的丰度降低了约2倍（图5A）。JS5/05和Herts/33组之间的比较表明， Herts/33感染过程中多种ECM蛋白的浓度增加（图5A）。感染后第3天，Herts/33组中COL1A1、COL1A2和COL14A1的浓度持续上调，但JS5/05并没有引起这些蛋白质丰度的显着变化（图5B）。此外，两种病毒都降低了包括糖蛋白、ECM附属蛋白和ECM调节剂在内的许多ECM蛋白的丰度，而JS5/05导致这些蛋白质丰度下降幅度更大（图5B）。感染后第3天对比Herts/33和JS5/05时没有发现显著差异的ECM蛋白。这些数据表明基因型VII NDV JS5/05导致ECM完整性和分子组成被明显破坏。

图5 | 感染JS5/05和Herts/33的鸡ECM蛋白丰度

 

接着作者分析了蛋白质组学鉴定出的所有胶原蛋白的丰度（图6A）。在注射后第1天，与阴性对照相比，JS5/05组脾脏中COL1A1和COL1A2的丰度分别降低了2.5倍和2.2倍，而Herts/33组中这两种胶原蛋白的丰度无显著变化。但是，Herts/33组中COL3A1的浓度提高了2.15倍。感染后第3天，与对照组相比，在Herts/33组的脾脏中鉴定到COL1A1、COL1A2和COL14A1浓度的增加。此时未在JS5/05感染组中检测到显著差异的胶原蛋白。这些结果表明，IV型NDV Herts/33基因型倾向于增加胶原蛋白的浓度，而VII型NDV JS5/05基因型则在不同感染阶段降低或未显著影响胶原蛋白的丰度。由于ECM成分与其他宿主因子高度相互作用，因此作者通过STRING数据库对两种代表性胶原（COL1A1和COL1A2）进行了相互作用网络分析。结果发现COL1A1和COL1A2与粘附受体高度相互作用（图6B）。另外，这两种蛋白质还与透明质酸受体CD44分子相互作用。KEGG通路分析表明，COL1A1或COL1A2及其相互作用的蛋白质参与了 ECM-受体相互作用、 PI3K-AKT信号通路等多种ECM相关通路（图6B）。这些发现表明，对ECM成分（例如胶原蛋白）以及与ECM蛋白相互作用宿主因子的调节，可能在基因型VII NDV感染过程中的宿主响应和病理结果中发挥作用。

图6 | 胶原蛋白浓度及COL1A1和COL1A2的相互作用网络

 

4.验证质谱数据

接着作者用胶原I和III特有的Picrosirius-red染色用于检测脾脏中胶原纤维的强度和完整性。在感染后第1天，在JS5/05组中可见胶原纤维的中度分解（图7A），而在Herts/33组或对照组中观察到完整且连续的红色胶原纤维（图7B和C）。在感染后第3天，JS5/05导致胶原纤维严重分解，并导致脾脏胶原网明显破坏（图7D）。相反，Herts/33组和对照组中胶原蛋白原纤维没有明显变化，并且胶原蛋白网络的结构仍然很大程度保留（图7E和F）。此外，与对照相比，JS5/05显著降低了脾脏胶原蛋白的丰度，而Herts/33则无显著变化（图7G）。因此组织学检查显示与Herts/33相比，JS5/05导致脾脏胶原蛋白的明显降解。

为了验证质谱数据，作者对COL1A2进行了ELISA检测。结果发现在感染后第1天，JS5/05组中COL1A2浓度明显降低，而Herts/33与对照组之间的COL1A2浓度无显著差异。感染后第3天， JS5/05组中COL1A2浓度同样显着降低，而Herts/33组中该蛋白与其他组相比无显着差异（图7H）。这些数据表明基因型VII NDV JS5/05降低了脾脏中COL1A2的浓度，结果与质谱数据一致。

                                                                                                                       图7 | 脾脏Picrosirius-red染色和COL1A2的ELISA检测

 

5.脾脏中MMP基因的表达及MMP-13的检测

为了确定JS5/05和Herts/33组间ECM蛋白丰度的差异是否与MMP介导的ECM降解有关，作者使用qRT-PCR检测了脾脏中三种代表性MMP（MMP-1，-13和-14）的基因表达。结果表明与对照组相比，JS5/05和Herts/33在感染后第1天增加了MMP-1基因的表达，且JS5/05组中MMP-1的上调程度大于Herts/33组。但是感染后第1天和第3天MMP-1基因表达无显著变化（图8A）。另外，与对照相比，两种病毒在感染后第1天都显着上调了MMP-13基因，但两种病毒之间无显著差异。而感染后第3天，只有JS5/05显着增加MMP-13表达（图8B）。此外，JS5/05和Herts/33在感染后第1天和第3天都上调了MMP-14基因的表达水平（图8C）。这些数据表明，与基因型IV NDV Herts/33相比，基因型VII NDV JS5/05显着上调了脾脏中MMP-13和MMP-14基因的表达。接着作者通过Western blot检测 MMP-13的蛋白表达，结果表明与Herts/33相比，JS5/05显着上调了脾脏中的MMP-13蛋白（图8D）。

图8 | 脾脏中MMP基因的表达及MMP-13蛋白的检测

 

实验结论

1) ECM蛋白质组学分析表明，与基因型IV NDV相比，基因型VII NDV菌株引起鸡脾脏，尤其是胶原蛋白中ECM完整性和分子组成的重大破坏。

2) 与基因型IV病毒Herts/33相比，基因型VII病毒JS5/05显着上调了ECM重塑胶原酶（MMP）。MMP上调和随后的ECM降解可能有助于鸡脾中基因型VII NDV的免疫病理表型。

3) 本文研究首次提供了NDV对ECM调节的证据，并将ECM重塑作为NDV病理的新表现形式，加深了对NDV发病机制的了解。

 

 

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基因型VII新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）具有明显的鸡脾脏免疫病理学特征。但是这种病理表型的机制尚未完全了解。该文章团队先前通过转录组学发现基因型VII NDV JS5/05组的脾脏中细胞外基质（ECM）比基因型IV病毒Herts/33下调更明显。因此本研究中使用TMT定量蛋白质组学揭示了ECM在VII型NDV基因型病理中的作用。病理表型表明JS5/05引起严重的免疫病理反应，脾脏明显坏死，而Herts/33仅引起轻度的病理变化。该研究建立了ECM蛋白富集体系，通过定量蛋白质组学鉴定发现与Herts/33相比，JS5/05导致ECM完整性和分子组成的重大破坏。此外，JS5/05感染显着上调了基质金属蛋白酶MMP-13和MMP-14。该研究结果表明，MMP上调和随后的ECM降解在脾脏基因型VII NDV的免疫病理中发挥重要作用。本文研究首次提供了NDV对ECM调节的证据，并将ECM重塑作为NDV病理学的新表现，加深了对NDV发病机制的了解。

 

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参考文献

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