【Q&A】25问PCT-DIA技术详解，教您攻克毫克级样本

针对近期结束的PCT-DIA技术讲座有很多老师来咨询，特此，小编将PCT-DIA讲座互动答疑分享帮助各位老师解答疑惑，希望更好的助力您的科研研究

Q1.差异表达蛋白怎么结合临床指标做分析，得出4个关键基因pi3k，用什么软件or程序？ 

基本的一个原理是：我们会将差异蛋白和临床指标统计数据进行相关性分析，基于皮尔森相关系数或斯皮尔曼等相关系数去做相关性分析。相关性系数在0.8以上的，可以判断某个差异蛋白和某个临床指标之间相关性比较高。鹿明生物的WGCNA产品，是专门针对蛋白质或代谢物与临床指标关联分析的成熟产品。

Q2.PCT-DIA组织样本准备上有什么要求？

低样本量就可以达到检测要求

Q3.请问PCT技术用到的高低压循环仪器是大型仪器吗？
PCT-DIA为大型仪器，针对微量样本的PCT-DIA蛋白质组技术服务。


Q4.普通做WB的样本就可以做PCT-DIA吗？
普通做WB的样本可以的，只要提取出来的蛋白，符合上机检测要求即可。


Q5.请问老师第二篇中抗体芯片就可以筛出银屑病相关的蛋白，DIA在本文中的优势体现在何处？（点击查看银屑病文章）
（1）DIA无需抗体：
第二篇《In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine》的抗体芯片，实际是作者查询大量文献和数据库后，拿到相关数据后，花费大量时间和经费定制的抗体芯片。抗体芯片检测的结果，也只能局限在抗体芯片上已有的抗体中。但是DIA技术无此限制，DIA技术尽可能多的去检测到样品中的蛋白质。

（2）DIA技术稳定性好：
相对于抗体芯片，DIA属于较新的技术。因此作者同时利用抗体芯片和DIA技术对样本进行检测，两者数据互相形成佐证。文献中对两种技术检测的结果分别进行了相关系数和变异系数（CV）的统计分析。

结果显示：抗体芯片技术检测的样本间定量的平均相关系数为0.99，变异系数（CV）分别为2.09%和5.72%。DIA技术检测的样本间定量的平均相关系数为0.85，变异系数（CV）为4.17%。该结果表明，DIA技术稳定性高。

（3）DIA技术检测动态范围广
作者对抗体芯片和DIA技术检测的动态范围进行了分析，数据结果表明DIA和抗体芯片实验的检测动态范围均在10个数量级左右，适用性广。

Q6.石蜡切片，需要多大量？4um需要几张白片？
通常我们建议老师按照10um的石蜡切片9片/样（3片装一管，另外2管作为备份），且每3片的重量保持在1mg以上。
那么针对4um的石蜡切片，则可按照24片/样（8片装一管，另外2管作为备份），且每8片的重量保持在1mg以上，其石蜡占比不能太多，造成实际样本的占重少。


Q7.DIA能鉴定到的蛋白是被局限在DDA所建的模型里吗？DIA相比DDA只是定量能力上的提高？
DIA采用的是全息扫描模式，获得的图谱非常繁杂，无法和目前的数据库进行直接比对，完成蛋白质的定性。因此，需要利用所有样本的混合样本建立DDA库，通过DDA库与数据库的比对，获得所有样本中蛋白质的定性数据。然后再将DIA技术鉴定到的质谱图和DDA库进行对比，最终获得我们每个样本中的蛋白质定性数据。因此DDA库的成功建立非常重要。经过多个DIA项目的积累，目前鹿明在DDA建库上已经积累了丰富的经验，可以顺利完成老师的DIA蛋白质项目。

DIA技术将整个质谱全扫描范围分为若干个窗口、高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行碎裂和检测，无差异、无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息。而DDA扫描模式，在每个扫描周期内，只采集一级质谱中丰度最高的10-20母离子信号的子离子碎片，其余信号的子离子信息丢失。因此DIA技术在单个样本上有能力获得比DDA扫描模式相对更加全面的蛋白定性信息，定性更加准确，且蛋白定性数量上更有优势。因此DIA相比于DDA除了在定量准确度和重复性上有极大的优势外，在定性的准确度和定性数量上也有很大的优势。


Q8.tp53，原癌基因+靶向药物确定的蛋白做ROC曲线，该怎么去选择基因？（差异蛋白一个个输入drugbank，然后看ROC曲线面积找是比较好的方法吗？）
经过质谱鉴定，获得蛋白定性和定量结果，通过统计指标Fold change、P-Value以及如GO、KEGG、PPI的分析，并且结合文献，找到目标蛋白或相关的原癌/抑癌基因。针对小批量的目标蛋白，比如十几二十个的目标蛋白，老师可以手动在drugbank中检索。针对大批量的目标蛋白，鹿明也有相关基于drugbank的产品，可以帮助老师进行大队列目标蛋白的分析。

制作ROC曲线，通常是用经过层层筛选后，对获得的小批量蛋白进行单指标或者多指标的ROC曲线制作。


Q9.请问临床指标与蛋白组学的相关网络图方面，临床指标怎么筛选？
针对临床指标与蛋白质组学的联合分析，前期我们都会和老师具体的沟通。针对老师的临床指标进行数据上的合理转换后，与我们蛋白质组学数据进行关联分析，筛选出关联性高的蛋白质。目前鹿明的WGCNA产品，是专门针对蛋白质或代谢物与临床指标关联分析的成熟产品。


Q10.如果DIA的数据需要依靠DDA建库的话，通常DDA建库时需要怎么样操作？
DDA建库时，首先我们会对每个样本进行酶解除盐，接着将所有样本的肽段等量混合，然后利用液相色谱仪对混合肽段进行分组份及质谱检测，获得混合肽段的谱图，利用搜库软件进行搜库，建立DDA库。


Q11.从DIA采集的数据中，具有针对性的选出凋亡等相关蛋白和明星通路，是人工一个个挑选吗？有其他高效的方法吗？
目前对于目标蛋白的筛选，基本是先基于我们检测到的所有蛋白，通过Fold change、P值等统计学指标可以批量地去筛选到差异蛋白，再针对差异蛋白进行诸如GO、KEGG、PPI的功能分析。但是最终想获得我们进行后续研究的目标蛋白，还是需要通过人工的方式进一步将功能分析和文献报道内容结合方可获得。人工挑选是目前无法跳过的一个步骤。


Q12.请问PCT提取蛋白是在低温条件下进行的吗？次生代谢物较多的植物样本蛋白，提取后酶解效果好吗？
PCT辅助样本裂解和酶解基本是在室温或者30℃的温度下进行。这个温度不仅适合样本在PCT仪中的裂解，也适合Lys-C和胰酶对蛋白的酶解。
鹿明生物在植物样本的蛋白鉴定上有着丰富的经验，并未出现实验最终酶解效果不好的情况。针对酶解效果的质控，我们会通过跑胶、肽段浓度鉴定和谱图分析等手段来对酶解效果进行质控。


Q13.我没听太懂DDA和DIA的不同，以及DIA的优势，能不能把原理讲的细一点？
DDA，又叫数据依赖型采集。质谱在扫描的时候，会分成许多个扫描的cycle，每个cycle里面会进行一级质谱和二级质谱的检测。在一级质谱的时候，只采集一级质谱中前面cycle未检测的丰度最高的10-20个母离子信号，打成碎片离子，进入到二级质谱中。那么在DDA扫描模式下，就会造成一些低丰度的肽段离子难以被检测到，且不同批次的样本仪器难以确保采集的丰度最高的10-20个母离子信号都一样，因此DDA扫描模式就会存在重复性和覆盖率相对较低的问题。

DIA，又叫数据非依赖型采集。质谱在扫描的时候，也会分成多个扫描的cycle，但每个一级质谱扫描的时候，会分成多个扫描窗口，每个窗口都会将所有母离子打成碎片，全部进入到二级质谱中进行检测。因此，DIA的扫描模式重复性和覆盖度相对于DDA会更好。
 

DIA与DDA对比

图 | DIA与DDA定量重复性对比
 

Q14.请问你们反馈给客户的DIA结果一般是什么形式的，是原始下机数据吗？
鹿明生物反馈给客户的DIA结果包括一份完整的项目报告，项目报告中会展现整个DIA实验流程、所用的仪器和试剂、数据质控分析、统计学分析和功能分析等。


Q15.不是必须要石蜡切片？冻存组织可以吗？唾液可以做吗，最少需要多少量？
目前PCT-DIA技术主要针对的样本类型有：细胞样本、石蜡组织穿刺样本、新鲜组织/临床活体穿刺组织、石蜡组织切片/甲醛固定组织切片，也包括了冰冻组织、花粉等微量样品。利用DIA技术的唾液样本量为≥500μl，针对PCT-DIA的唾液样本量目前暂时未定。


Q16.DDA 给DIA 建库，由于目标蛋白丰度低，20个fractions 也未检测到目标蛋白，可以在准备DDA样本时，加入某种目标纯蛋白么？
如果老师已经非常明确想要检测某个蛋白，可以直接采用PRM靶向蛋白技术去鉴定目标蛋白。目前PRM靶向蛋白技术，可以同时在样本中靶向检测几十个蛋白。鹿明建议老师通过前期的实验积累，挑选出40个以内的意向蛋白，利用PRM靶向蛋白质技术去靶向检测这40个意向蛋白。


Q17.常规的样本都可以用PCT来做前处理吗？
常规样本建议采用DIA及其他常规蛋白质组技术即可。


Q18.go和kegg里面聚集出来的蛋白几乎都被别人研究了，我们再做一些简单验证有意义吗？就是肿瘤不一样，是不是创新性缺乏？
增加创新性的方法：
（1）样本：可以选择一些稀有，独特的样本进行分析；
（2）疾病类型：肿瘤的明星通路虽然有限，有很多蛋白也已经被研究，但是某些蛋白只在某类疾病中研究过，可以考虑在其他类型的疾病中对该种蛋白进行研究；
（3）与多种临床指标进行关联分析；
（4）结合多组学的手段分析；
（5）扩大样本类型，或者进行相关的功能研究，如对细胞、组织、动物模型等去做进一步的研究。
研究通路中没有的蛋白，可以增加创新性，但是要花费更多的精力。因此还是建议老师从通路中有的蛋白入手，
结合上面讲到的增加创新性的办法，做深入挖掘。


Q19.做人群研究的话，只能通过抽血，这个会不会影响很多蛋白的检测？
不会影响。血液样本目前收血清和血浆样本，提供300-500ml的血清或血浆样本即可。


Q20.请问目前想要用DIA针对不常见的修饰做定量分析，可以吗？
目前鹿明有成熟的磷酸化DIA产品，可以分析磷酸化位点、磷酸化肽段和对应的蛋白。


Q21.长期保存的病理蜡块或者病理切片能用来分析吗？
PCT-DIA技术可以分析此类样本。一般我们建议用一年以内的病理蜡块或者病理切片，而对于时间过长的样本，我们建议老师先送部分样本，我们进行预实验，对样本进行评估。


Q22.血清高丰度蛋白要不要去除呢？
根据我们多年的血清质谱检测项目经验来讲，建议去除。因为在质谱检测时，高丰度蛋白会抑制低丰度蛋白的检出，去除血清中常见的十几种高丰度蛋白后，更有利于一些相对低丰度且有研究价值的蛋白的检出。


Q23.液氮标本和石蜡标本结果有多大差异？
石蜡样本相对于液氮保存/冻存样本，蛋白降解的可能性更大。但是具体液氮标本和石蜡标本的结果差别有多大，要具体看石蜡标本保存的情况。


Q24.有没有办法能不破坏病理切片情况下取样？
由于要进行蛋白抽提，因此无法避免对病理切片的破坏。建议老师可以一部分病理切片用来做蛋白鉴定，另外再留存部分病理切片


Q25.保存在低温下的长期保存的病理蜡块或者病理切片也能做PCT-DIA吗？（病理科普通长期保存的样本）
非低温保存的病理蜡块或病理切片是可以用PCT-DIA鉴定蛋白的。对于长期保存的样本，比如5年、10年的样本，我们建议老师可以先送少量样本过来，我们先进行一个预实验。