【Q&A】蛋白微量样本PCT-DIA技术解析及研究策略-上篇

2020年3月3日已完成的《蛋白微量样本PCT-DIA技术解析及研究策略》直播讲座，广受听众一致好评，谈论非常热烈。本期小鹿特地梳理了蛋白组学PCT-DIA技术大家关注的一些问题。共分为上下2篇，请老师们持续关注哦~~

Q1：差异表达蛋白怎么结合临床指标做分析，得出4个关键基因pi3k，用啥软件or程序？

基本的一个原理是：我们会将差异蛋白和临床指标统计数据进行相关性分析，基于皮尔森相关系数或斯皮尔曼等相关系数去做相关性分析。相关性系数在0.8以上的，可以判断某个差异蛋白和某个临床指标之间相关性比较高。鹿明生物的WGCNA产品，是专门针对蛋白质或代谢物与临床指标关联分析的成熟产品。老师可以和销售联系，获得鹿明WGCNA的项目报告案例。

Q2：组织准备上的要求？
 

低样本量就可以达到检测要求

Q3：请问PCT技术用到的高低压循环仪器是大型仪器吗？

PCT-DIA为大型仪器。针对微量样本的PCT-DIA蛋白质组技术服务，在国内，是鹿明生物提出的专属产品。欢迎各位老师们咨询技术详情~

Q4：普通做WB的样本就可以做PCT-DIA吗？

普通做WB的样本可以的，只要提取出来的蛋白，符合上机检测要求即可。详情可添加文末小助手微信咨询哦~

Q5：请问老师第二篇中抗体芯片就可以筛出银屑病相关的蛋白，DIA在本文中的优势体现在何处？（点击查看银屑病文章）

（1）DIA无需抗体：

第二篇《In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine》的抗体芯片，实际是作者查询大量文献和数据库后，拿到相关数据后，花费大量时间和经费定制的抗体芯片。抗体芯片检测的结果，也只能局限在抗体芯片上已有的抗体中。但是DIA技术无此限制，DIA技术尽可能多的去检测到样品中的蛋白质。

（2）DIA技术稳定性好：

相对于抗体芯片，DIA属于较新的技术。因此作者同时利用抗体芯片和DIA技术对样本进行检测，两者数据互相形成佐证。文献中对两种技术检测的结果分别进行了相关系数和变异系数（CV）的统计分析。

结果显示：抗体芯片技术检测的样本间定量的平均相关系数为0.99，变异系数（CV）分别为2.09%和5.72%。DIA技术检测的样本间定量的平均相关系数为0.85，变异系数（CV）为4.17%。该结果表明，DIA技术稳定性高。
 

（3）DIA技术检测动态范围广

作者对抗体芯片和DIA技术检测的动态范围进行了分析，数据结果表明DIA和抗体芯片实验的检测动态范围均在10个数量级左右，适用性广。

Q6：石蜡切片，需要多大量，4um需要几张白片？

 
通常我们建议老师按照10um的石蜡切片9片/样（3片装一管，另外2管作为备份），且每3片的重量保持在1mg以上。

那么针对4um的石蜡切片，则可按照24片/样（8片装一管，另外2管作为备份），且每8片的重量保持在1mg以上，其石蜡占比不能太多，造成实际样本的占重少。需要具体咨询请扫码文末助手~

Q7：DIA能鉴定到的蛋白是被局限在DDA所建的模型里吗？DIA相比DDA只是定量能力上的提高？

DIA采用的是全息扫描模式，获得的图谱非常繁杂，无法和目前的数据库进行直接比对，完成蛋白质的定性。因此，需要利用所有样本的混合样本建立DDA库，通过DDA库与数据库的比对，获得所有样本中蛋白质的定性数据。然后再将DIA技术鉴定到的质谱图和DDA库进行对比，最终获得我们每个样本中的蛋白质定性数据。因此DDA库的成功建立非常重要。经过多个DIA项目的积累，目前鹿明在DDA建库上已经积累了丰富的经验，可以顺利完成老师的DIA蛋白质项目。

DIA技术将整个质谱全扫描范围分为若干个窗口、高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行碎裂和检测，无差异、无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息。而DDA扫描模式，在每个扫描周期内，只采集一级质谱中丰度最高的10-20母离子信号的子离子碎片，其余信号的子离子信息丢失。因此DIA技术在单个样本上有能力获得比DDA扫描模式相对更加全面的蛋白定性信息，定性更加准确，且蛋白定性数量上更有优势。因此DIA相比于DDA除了在定量准确度和重复性上有极大的优势外，在定性的准确度和定性数量上也有很大的优势。

Q8：tp53，原癌基因+靶向药物确定的蛋白做ROC曲线，该怎么去选择基因（差异蛋白一个个输入drugbank，然后看ROC曲线面积找是比较好的方法吗？）

经过质谱鉴定，获得蛋白定性和定量结果，通过统计指标Fold change、P-Value以及如GO、KEGG、PPI的分析，并且结合文献，找到目标蛋白或相关的原癌/抑癌基因。针对小批量的目标蛋白，比如十几二十个的目标蛋白，老师可以手动在drugbank中检索。针对大批量的目标蛋白，鹿明也有相关基于drugbank的产品，可以帮助老师进行大队列目标蛋白的分析。

制作ROC曲线，通常是用经过层层筛选后，对获得的小批量蛋白进行单指标或者多指标的ROC曲线制作。

以上问答没有看够？别着急我们还有下篇的文章推出哦~

看完这满屏的干货问答，您是不是对我们的《蛋白微量样本PCT-DIA技术解析及研究策略》有了更深入的了解了呢？如果您对PCT-DIA技术感兴趣，您可以通过添加微信小助手获取我们的回放链接和咨询PCT-DIA相关技术。

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