奥林巴斯助力绘制全球首.个椎间盘单细胞转录组图谱

本文作者：Christine Zheng
陆军军医大学陆军特色医学中心

随着社会老龄化程度不断升高，导致椎间盘退行性疾病的发病率日渐上升，并呈年轻化趋势。椎间盘退行性疾病（DDD）是导致腰腿部位疼痛的主要原因，不仅影响患者的生活质量，而且对社会的医疗和经济资源带来了沉重的负担。

目前对于 DDD 的治疗，主要依靠卧床、康复治疗、药物、介入及手术治疗等手段，但这些手段只能减轻患者的症状，很难重建椎间盘（IVD）的稳态环境。因此，急需深入探索椎间盘生理与病理机制，对椎间盘退行性疾病的治疗具有重大指导意义。

由于椎间盘细胞的高度异质性以及复杂的细胞微环境，以往的研究通过 bulk RNA 测序解析椎间盘内分子事件已很难满足深入研究的需要，导致椎间盘的生理与病理机制仍然远未阐明。
 

近日，陆军军医大学陆军特色医学中心（重庆大坪医院）骨科 刘鹏课题组 与中国人民解放军总医院第五医学中心 刘兵课题组 联合，在陆军医大学陆军特色医学中心（重庆大坪医院）陈林课题组 的支持下，绘制了首.个人类椎间盘细胞图谱，在 Bone Research 发表了题为  Spatially defined single-cell transcriptional profiling characterizes diverse chondrocyte subtypes and nucleus pulposus progenitors in human intervertebral discs 的封面研究论文。

该论文利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、免疫组化、免疫荧光、流式分选等技术对人类椎间盘髓核、纤维环以及软骨终板内的细胞进行分析，系统地绘制了椎间盘的单细胞转录图谱，精准揭示了细胞间的异质性，为椎间盘退行性疾病的临床治疗策略提供了新思路。

研究人员采集了 11 个椎间盘，并且对髓核、纤维环、软骨终板组织进行分离，分别从以上组织中分离提取细胞，对细胞进行单细胞转录组测序。

在经过质控和多连体排除后，作者对 108,108 个单细胞进行了测序，通过对 2,651 个差异表达基因（DEGs）进行分析，并对测序数据进行 tSNE 可视化处理，最终得到了 9 个亚群。

这些亚群包括 3 个 SOX9+ 软骨细胞亚群、脊索细胞、基质细胞、周细胞、内皮细胞、髓核祖细胞以及血细胞。

随后，作者对样本进行了免疫组化染色，验证了几个主要细胞亚群在椎间盘中的空间定位 (图 1)。 

此外，为了验证这种椎间盘细胞的异质性在物种间具有高度的保守性，作者比较了人类与大鼠间椎间盘细胞的单细胞转录组测序数据，发现多数在人类椎间盘的细胞亚群在大鼠椎间盘中同样存在，包括髓核祖细胞，内皮细胞，以及周细胞。
 

图 1：健康人椎间盘中 AF（纤维环）NP（髓核）CEP（软骨终板）的免疫组化染色

作者通过进一步的研究，根据功能的差异，将椎间盘软骨细胞分为三类：

1、调控型软骨细胞通过活跃的生长因子表达和成软骨信号通路调控，在软骨 ECM 稳态中发挥重要作用。
2、高度分化的稳态软骨细胞处于静息状态，主要负责 ECM 的沉积。
3、效应型软骨细胞处于高代谢活性状态，与维持椎间盘中 ECM 的合成密不可分，并且具有 PRG4 高表达的特性，能够降低剪切压力与感染的损伤，对关节具有保护作用。

此外，作者团队通过免疫染色发现，在髓核区域内存在一群 PDGFRA+PROCR+ 的软骨祖细胞亚群，这群细胞具有潜在的干性，并且特异性表达 PRRX1（图 2）。
 

图 2：免疫荧光染色显示 PDGFRA/PROCR/PRRX1 在人类椎间盘细胞内的共表达情况

随后，作者通过流式细胞分选，将不同的细胞亚群进行了纯化富集。
 

通过体外实验，研究人员发现与 PROCR-细胞亚群相比，PROCR+ 亚群具有很强的体外克隆形成能力。免疫荧光染色结果提示，在 PROCR+ 细胞亚群中，软骨生成相关转录因子 p-SMAD3 高度活化（图 3）。最后的体外分化实验证实，PROCR+ 祖细胞具有成骨、成软骨以及成脂的三系分化能力（图 4）。
 

图 3：免疫荧光染色揭示 PROCR+ 与 PROCR- 亚群中 p-SMAD3 的表达差异

图 4：PROCR+ 亚群经过成骨、成脂、成软骨诱导后的茜素红、油红 O、阿尔新蓝、蕃红 O-固绿染色

综上，该研究通过单细胞表达谱测序，首次绘制了人类的椎间盘单细胞图谱，在单细胞水平上定义了软骨细胞亚群，让我们对椎间盘细胞的异质性有了全新认识；并且作者在空间上对这些不同的亚群进行了解析和定位，通过基因分析揭示了它们的调控特征。
 

此外，作者团队在髓核中鉴定得到一群具有干性潜能的祖细胞，为人类椎间盘退行性疾病的治疗提供了新的理论基础。

文中组织切片的图像主要利用奥林巴斯 VS200 研究级全玻片扫描系统获得，该系统支持明场与荧光等五种常见的观察方法，通过配置的 X Line 高性能物镜，可以为用户提供平场性更好的图像；自动聚焦和自动样品检测功能可以使系统的拍摄效率大大提高，同时不失精准；TruAI 深度学习技术的强大功能，可以准确识别出样品的形态特征，并且可以准确分割目标区域，在简单易学的前提下帮助用户节约分析图像的时间。

此外，细胞的免疫荧光染色图像主要通过奥林巴斯全新一代超高分辨转盘共聚焦系统 SpinSR10 获得，该系统具有奥林巴斯特有的超高分辨模块，无需特殊荧光标记染料，XY 分辨率可达到 110 nm，轻松解析精细结构；基于转盘的共聚焦扫描单元可以实现高帧率的图像采集，不错过每一个瞬间；该系统极低的光毒性对标本的破坏很小，尤其适用于活细胞的观察。
 

陆军军医大学陆军特色医学中心（大坪医院）骨科 刘鹏教授 与 解放军总医院第五医学中心 刘兵研究员 为该论文的共同通讯作者，甘翼搏 博士后与 贺健 博士为论文的共同第一作者，陆军特色医学中心为第一完成单位。该工作也得到了陆军特色医学中心陈林教授课题组的参与和支持。