微型化双光子显微镜在皮肤诊断中的应用

随着光学技术的发展，双光子显微镜以其独有的技术优势被广泛地应用于活体组织成像。生物组织中含有很多内源荧光团，分布于皮肤组织的NAD(P)H,FAD,胶原蛋白，弹性蛋白，黑色素等皮肤组分中，在适当的飞秒激光激发下可产生稳定的双光子荧光信号。此外，飞秒激光还会引起皮肤组织中的非对称结构产生二次谐波信号，因此通过合理设置收集通道的滤光片，即可在同一台光学显微镜下，同时获得双光子自发荧光图像和二次谐波图像，实现双模态信号检测。这种方法在皮肤衰老检测，皮肤疾病检测方面有着巨大的应用潜力，并已获得初步成果。

内源荧光分子激发光谱                                                                  内源分子发射光谱

双光子激发的原理

在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的弛豫时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。

双光子激发原理

二次谐波原理

二次谐波成像是一种非线性的光学过程，在此过程中，两个相同频率光子与非对称介质发生相互作用，将其从基态激发至虚态。在从虚态恢复到基态的过程中，释放频率增倍、波长减半的光子。

二次谐波成像原理

双光子荧光显微镜在皮肤成像中的优势

与传统的单光子显微镜相比，双光子显微镜具有如下优势：

1，采用红外波长进行激发，而长波长在生物组织内吸收和散射都比较小，因此可对深层组织进行成像；

2，使用飞秒激光器对荧光分子进行脉冲激发，峰值能量高，平均能量低，因此光毒性和光漂白小都很小；

3，具有很好的光学层析成像能力，能够进行不同深度组织的成像；

4，而相对于现有的组织病理诊断技术，双光子成像具有无创检测、实时观察，快速诊断等特点。并且自发荧光

成像技术在成像时不需要外源荧光基团进行标记，在临床检测中具有安全性。

皮肤检测标志物的意义

• NADH/NADPH

皮肤组织中的NADH/NADPH是皮肤衰老检测的重要标志物之一，其含量于皮肤组织中的氧化还原和新陈代谢相关；其产生伴随着能量物质ATP的产生，而细胞能量可直接反应细胞的代谢与衰老，研究发现NADPH随着年龄的增加在细胞内的合成水平呈下降趋势。

• 胶原蛋白纤维

皮肤中的胶原蛋白纤维和结构、形态、分布和衰老相关。年轻皮肤胶原蛋白纤维含量丰富，排列紧致，呈不定型状，而衰老皮肤结构排列稀松，呈丝状。

• 弹性蛋白纤维

胶原蛋白纤维在年轻皮肤和衰老皮肤中的结构和分布不同。衰老肌肤弹性蛋白纤维结构排列混乱，并呈现弯曲伸展状；而年轻肌肤网格结构分布良好，且呈现直线延申状。

• 黑色素瘤

黑色素瘤起源于黑色素细胞，黑色素瘤患者黑色素细胞的形态和边界与正常人黑色素细胞不同。

成像示例

多光子技术获取不同深度皮肤组织的自发荧光图像

超维景生物使用780 nm飞秒激光作为成像激发光源，激发人体皮肤中的自发荧光和二次谐波信号，可对不同深度不同区域的皮肤组织进行成像。包括皮肤角质层、颗粒层、棘层、基底层和真皮乳头层。

不同皮肤组织的成像

参考文章：

［1］ DENK W，STＲICKLEＲ J H，WEBB W W． Two－photon laser scanning fluorescence microscopy［J]. Science，1990，248 ( 4951) : 73-76

  [2］ KNIG K. In Vivo Clinical Applications［OL].［2018-02-20]． http: / /mpt-tomography．de/vivo-  clinical-applications

［3］席鹏，刘宇嘉，姚志荣，等．用于皮肤影像诊断的光学成像方法［J]．中国激光，2011，38( 2) : 7-19