多重naica®数字PCR法在同时监测水质中多种细菌种类和计数的应用

导读

在现代水产养殖中，水产养殖系统是为鱼类或其他物种的集约养殖而设计，其水质直接影响鱼类的健康和生产，而微生物在去除有机物和氮循环、有毒硫化氢(H₂S)的产生方面发挥着至关重要的作用，微生物种类和数量会直接影响鱼类的健康，准确计数特定种类的细菌对控制潜在风险至关重要，尤其是那些对养殖鱼类及其最终消费者具有致病性的细菌。因此亟需高精度、高特异性、高敏感性且快速的方法，监测特定种类的细菌和数量。

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean科学家建立基于naica^®微滴芯片数字PCR系统的多重数字PCR绝对定量评估鲑鱼三种关键病原体、人病原体单核增生李斯特菌、影响鲑鱼生存环境的硫酸盐还原菌(SRB)，用于水产养殖的相关优势细菌进行监测。

该方法在发表于《Journal of Microbiological Methods》杂志上，题为“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”。

应用亮点：

▶  使用naica^®微滴芯片数字PCR系统直接绝对定量水产养殖系统中五种细菌。

▶  开发同时定量水产养殖水质检测相关五种细菌的多重数字PCR检测方法。

▶  基于naica^®微滴芯片数字PCR检测方法具有灵敏度高、特异性高、耗时少的优势。

科学家建立数字PCR方法监测与鲑鱼养殖生产过程中三类不同的细菌：

第一类：鱼类病原体，与鱼类的溃疡性疾病有关的粘放线菌Moritella viscosa，会引起肠性红嘴病的鲁氏耶尔森菌Yersinia ruckeri以及与鱼类的细菌性冷水病有关的黄杆菌Flavobacterium psychrophilum。

第二类：人类病原体，可以从海产品转移到消费者身上的人病原体，单核增生李斯特菌Listeria monocytogenes。

第三类：破坏鱼类生长环境的细菌。通常硫酸盐还原细菌（SRB）在厌氧条件下通过将硫酸盐（SO42-）转化为有毒的硫化氢（H2S）来影响鱼类健康。可通过以脱硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans为参考菌株进行SRB检测。

研究学者利用naica^®微滴芯片数字PCR系统的单重和多重检测方法对上述优势菌种进行绝对定量。结果表明粘放线菌Moritella viscosa，鲁氏耶尔森菌Yersinia ruckeri，黄杆菌Flavobacterium psychrophilum检出限低至20fg，李斯特菌Listeria monocytogenes和脱硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans DNA检测含量可低至2fg，均具有更宽的线性范围，线性拟合度R²均在0.999以上（图1）。多重naica^®微滴芯片数字PCR系统检测结果与单重分析中检测到的目标基因浓度吻合（图2，图3）。此次研究充分证明了naica^®微滴芯片数字PCR系统可以同时精确定量复杂水质样品中多种类细菌。

▲图1：naica^®微滴芯片数字PCR系统定量5种细菌的线性回归图，分别给出相应的方程和回归系数。

▲图2：对鲁氏耶尔森菌Yersinia ruckeri（A）黄杆菌Flavobacterium psychrophilum（B）的单、双重分析结果进行比较。在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加鲁氏耶尔森菌Yersinia ruckeri ，黄杆菌Flavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀释后进行基因拷贝数定量。

▲图3：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，单重(圆形)和三重(三角形)测定的靶基因拷贝浓度绘制。恒等线表示每个点的X坐标和y坐标相等的位置。
 

原文链接如下：http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean为全球开展的海洋相关科学研究和创新，致力于海洋技术、生物标记和海洋环境技术研究。