开启基于微滴数字 PCR 的无创产前检查之路

近年随着无创产前检查（NIPT）市场的不断增长，在许多国家的指南中也越来越多地鼓励 NIPT 进行怀孕的风险评估。然而，目前大多数商品化的 NIPT 产品都是基于 NGS 的技术和平台进行，这种测序方法成本高且周期较长。

日前总部位于韩国首尔的 BioCore 公司宣布，将于本月在韩国开始提供基于 Bio-Rad QX200 微滴数字 PCR（ddPCR）的胎儿 T21 无创产前测试，其成本大约是 NGS 检测的一半，检测周期短，大约仅需要 1 到 2 天时间，且 2 毫升血浆即可满足检测要求。QX200 ddPCR 可同时检测多个样本，操作简便，结果判读容易，无需复杂的生物信息学分析。

我们通过该公司 2018 年初在 Clinica Chimica Acta 上发表的一篇文章^[1] 来看看该方法的设计思路和验证过程。

研究中入组的 976 个孕妇血液样本信息如下：

其中包括 T21 阴性样本 923 个，T21 阳性样本 53 个；其中 52 个样本用于 NIPT ddPCR 体系建立；47 个阴性样本用于 Cut-off 值的确立；最后 877 个样本用于临床测试。

除了临床样本，研究中还用到了羊水样本、正常细胞系和 T21 细胞系，以及普通人全血样本，用于设定 cut-off 值。

ddPCR 引物探针的设计：

为了克服 cffDNA 片段化的影响，该方法选择了 21 号染色体上的 4 个位点；作为参照，在 1 号，2 号染色体上各选择一个位点设计 引物探针。

➤ 样本处理

在方法构建过程中，从细胞系提取的 gDNA 经过片段化处理（<200bp），以模拟 cffDNA 的片段化状况；为了增加 cffDNA 的比例，对于血浆样本进行了片段筛选，以确保大量 200bp 左右的 cfDNA 片段，浓度超过 500pg/uL 的样本用于 ddPCR NIPT 检测。

➤ Cut-off 值的设定

通过对四种不同类型的 DNA 样本（157 个阴性样本，3 个阳性样本）进行分析，以划定不同组别样本的 cut-off 值：

基于以上结果设定 cut-off（Target/Control）值为 1.15，小于 1.15 的比值判划为 T21 低风险，大于等于 1.15 的比划为 T21 高风险。

➤ 临床样本测试

为了验证 ddPCR NIPT 检测方法的临床准确性，对临床 877 份血浆样本进行了盲测分析：

灵敏度达到 100%，特异性可达 99.64%，总体的准确性为 99.66%。

与此相似的方法还有 2016 年法国的研究团队发表在 PlosOne 的研究结果^[2]，也是通过对 21 号染色体设置 4 组探针（与此研究的靶标基因不同），再分别对 1 号染色体和 2 号染色设计一组探针作为参考基因，利用 Bio-Rad QX100 平台对 213 名胎儿染色体异常高风险孕妇的血浆 DNA 样本进行了检测。而 BioCore 将成为第一个基于 ddPCR 技术的 NIPT 商业化的公司。

已有越来越多的研究人员将 ddPCR 这项技术与平台针对无创产前检查开发相关的检测方案，除了上文中提到的用于产前进行胎儿染色体数目异常的筛查，还有报道利用 ddPCR 对胎儿常染色体隐性单基因疾病的非侵入式的检测^[3]，胎儿的甲基丙二酸血症风险的无创性产前诊断^[4]、检测母体血浆中 F8 与 F9 的突变情况预测胎儿血友病的状态^[5]。

参考文献：

1. Lee, Seung Yong, et al. "A new approach of digital PCR system for non-invasive prenatal screening of trisomy 21." Clinica Chimica Acta 476 (2018): 75-80.

2. El Khattabi, Laïla Allach et al. 「Could Digital PCR Be an Alternative as a Non-Invasive Prenatal Test for Trisomy 21:

A Proof of Concept Study.」 Ed. Kelvin Yuen Kwong Chan. PLoS ONE 11.5 (2016): e0155009. PMC.

3. Chang, Mun Young et al. 「Development of Novel Noninvasive Prenatal Testing Protocol for Whole Autosomal Recessive Disease Using Picodroplet Digital PCR.」 Scientific Reports 6 (2016): 37153. PMC.

4. Gu, Wei et al. 「Noninvasive Prenatal Diagnosis in a Fetus at Risk for Methylmalonic Acidemia.」 Genetics in medicine : official journal of the American College of Medical Genetics 16.7 (2014): 564–567. PMC.

5. Hudecova, Irena, et al. "Noninvasive detection of F8 int22 h-related inversions and sequence variants in maternal plasma of hemophilia carriers." Blood (2017): blood-2016.

文中产品仅用于科研用途，不用于临床诊断

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