​实验技巧 | 你知道流式细胞术有八大对照吗？

对照在任何实验中都是非常重要的，对照设置的越充分我们的实验结果可以解读的越精准。尤其在流式细胞术中，对照可以将实验结果和背景区分，排除非特异性的效应，获得高质量的数据结果。可是你知道吗？流式细胞术有八大对照，以下我们将一一讨论：

1. 未染色对照（也作空白对照）
流式细胞术中找到细胞群的首要步骤就是要建立 FSC-SSC 图，接着我们就要确定阴性细胞群的位置，这时候我们就要用到未染色对照，它可以告诉我们背景荧光或自发荧光的强度，帮我们设定各个通道的电压以及圈定正确的阴性细胞群的位置。

图一 未染色对照：未染色的淋巴细胞用来确定阴性细胞群的位置 (a)，染了 CD4(MCA1267) 和 CD8(MCA1226) 抗体后可见 CD4 和 CD8 的阳性群 (b)。

2. 同型对照
在流式细胞术中，染色的背景水平是一个问题，特别是在为罕见的低表达水平的细胞建立多色模板时。同种型对照的作用是确保观察到的染色是由于特异性抗体与靶标的结合而不是非特异结合产生的。 它们不应用于确定阳性和阴性的设门，并且可能不适用于胞内染色。 要了解更多关于如何选择同种型对照，请访问 https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-isotype-controls.html。
 
3. 单染和补偿对照
当进行多色流式实验时，单染色样品对于确定补偿水平至关重要。 单独染色将显示不同荧光团之间光谱重叠的水平，并允许您去除或补偿此重叠。当使用单个染色样品进行补偿时，要考虑的重要事项是荧光基团需要相同，其亮度与实验中使用的相似，需要收集足够的事件才能具有统计学意义。

图 2 荧光单染校正光谱重叠。CD45RA FITC(MCA88) 单染的淋巴细胞在 PE 通道中检测到荧光 (a)，但在正确补偿后 FITC 荧光未溢漏到 PE 通道 (b)。

4. 死活对照
样品中死细胞的存在可能会极大地影响染色，从而影响数据质量。因为死细胞具有更大的自发荧光，而且会增加非特异性抗体结合，导致假阳性并降低动态范围。 这可能会使弱阳性样本和稀有群体的鉴定变得困难。使用基于前向和侧向散射的门可以帮助清除碎片和死细胞，但它不会将它们全部移除。 需要使用用于鉴定死细胞的活性染料，这些染料的类型包括 DNA 染料，例如 ReadiDropTM PI 或 ReadiDropTM 7-AAD，和蛋白质结合染料如 VivaFixTM 系列染料，染色后还可固定。

图 3 使用死活染料去除死细胞可以改善染色。 人外周血样本：(a) 左图使用前向侧向散射图圈出目标细胞（红色矩形），不能去除所有死细胞，右图 CD3 和 CD14 的图中某些非特异性结合仍然存在。(b) 左图使用碘化丙啶染色（红色矩形）排除死细胞，右图显示较少的非特异性结合，更容易识别阳性染色的群体。 

5. Fc 阻断对照
Fc 受体位于单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞和 B 细胞上。顾名思义，它们通过其恒定的 Fc 结构域而不是抗原特异性 Fab 结构域结合抗体。这种结合会导致假阳性。为了防止这种类型的结合，已经开发了 Fc 封闭试剂（例如人 Fc Seroblock 和 Murine Fc Seroblock），当加入到染色方案中时，可以确保仅观察到抗原特异性结合。

图 4 Fc 阻断。(a) 人 THP-1 细胞用 FITC 标记的小鼠抗人 CD11a(MCA1848) 和小鼠 IgG2a 同型对照染色后，出现染色效果一致；(b) 加入人 SeroBlock (BUF070A) 后，阳性得以真实区分。

6. 荧光减一 (FMO) 对照
荧光减一 (FMO) 对照建立多色方案时是非常重要的，因为它们将帮助你确定感兴趣的门应该在哪里设置，尤其是在表达水平很低需要从较大百分比的阴性群体中识别阳性时，FMO 特别重要。当获取多色数据时会有荧光散布的问题，特别是亮的荧光素在补偿和交叉激光激发之后特别明显。仔细的实验设计将有助于减少这种影响，FMO 对照在这时也很重要。 FMO 对照是用实验设计里的所有荧光减去一个荧光后染色的细胞样本。 FMO 矩阵的例子如下表 1 所示。图 5 显示了其他通道的荧光散布如何影响数据。在开始新的多色实验时，应对 panel 中的所有荧光设计 FMO 对照。这样可以评估所有荧光素在仪器通道中的散布程度，并据此设置相应的的门。

图 5. 使用 FMO 对照来确定荧光散布及设置精确的门。 第一张图使用空白对照确定阴性和阳性细胞群的界限；第二张图是缺乏 PE-Cy5 的 FMO 对照，可以看到其它荧光素对该通道产生了散布，使得隐性和阳性细胞群的界限发生改变，得到黑色虚线；第三张图全染后分析样本，按照黑色虚线精确设定阴阳性界限。

7. 细胞内染色对照
针对细胞表面染色，同种型对照可以排除非特异性结合。 但是当实验涉及细胞内染色时，由于需要固定和透膜，这些步骤会影响抗原检测，自发荧光，荧光素亮度和细胞形态，所以其它的对照是必要的。 这些对照可以包括生物对照，例如刺激/阻断实验和正确的阴性对照，这些对照需要同样经过固定和透膜步骤。关于如何优化胞内染色请继续关注我们，在伯乐生命科学公众号上我们会呈现给大家。
 
8. 生物学对照
生物学对照对于所有染色都是重要的，但对于具有更高背景荧光的细胞内染色更重要。生物学对照包括已知的阴性样品和已知的阳性样品。举一些例子：从文献中已知的表达或缺乏感兴趣抗原表达的细胞，或使用 RNAi 或 CRISPR 技术将抗原敲除的细胞产生阴性细胞，或已转染的细胞并且抗原被过度表达以确保阳性染色。对于一些实验，例如细胞因子释放检测，未刺激和完全刺激的样品对于确定阳性结果和细胞因子的动态变化是很重要的。

八大对照是流式细胞术中的几个重要考虑因素之一，其他还包括仔细的样品制备，粘连体鉴别，抗体方案设计等。其中许多在我们近期的伯乐生命科学公众号上都会涵盖，大家可以持续关注我们。如此精密的流式实验当然需要高端的仪器来实现，Bio-Rad 的智能高端仪器 ZE5 具有 5 激光 30 个参数可以让我们更容易找到相互之间荧光散布影响更小的通道组合，在重要的荧光素选择以外方便添加死活染料；每秒 10 万个细胞的上样速度让我们快速的找到那些非常少量表达的细胞群；每根功率达到 100 mw 的激光器让我们更加灵敏的区分阴阳性细胞群；超级友好的软件界面可以自动识别荧光素所在的通道，帮助考虑荧光素之间的补偿和散布程度，补偿更容易实现，使用起来游刃有余。
 
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以上产品仅用于研究使用，不用于临床诊断。

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