应用分享 | 奇思妙想：微滴式数字 PCR 应用单细胞捕获研究

近年来，微滴式数字 PCR（ddPCR）技术因其革新的技术优势（突破 qPCR 的技术瓶颈）、独特的魅力（功能的全面性及易用性），成功赢得科研、医学和检验检疫等行业相关研究者的青睐。其应用范围广泛，涵盖了核酸精准定量、单细胞基因表达、拷贝数变异（CNV）、疾病分子标志物监测、肿瘤驱动基因液体活检、病原微生物检测及转基因检测等诸多热门研究领域，与二代测序（NGS）等高新技术配合默契。虽然 ddPCR 技术的本职工作是对可进行 PCR 扩增的目标核酸（DNA 或各种 RNA）进行绝对计数，但禁不住科学家们脑洞大开，有人已成功运用 ddPCR 技术进行单细胞内目标 mRNA 和蛋白的定量检测^[1]，还有人用其评估水中重金属离子的含量^[2]，该技术的应用潜力可见一斑。在技术面市初期，就有人大胆设想，既然 ddPCR 技术中可用纳升级微滴分割和捕获核酸，那么是否也能包裹捕获比微滴小的单个细胞，从而实现对目标细胞的计数呢？今天这个奇思妙想终于被一些勇于创新的科学家们实现了，下面就让我们一起来看一篇来自日本科学家的研究报道吧^[3]。

背景介绍：
原发性免疫缺陷病（PIDs）为一种先天性免疫功能障碍疾病，大多与遗传因素有关，临床主要表现为出生后反复感染。当患者找不到人类白细胞抗原（HLA）匹配的合适供体进行造血干细胞移植（HSCT）时，干细胞基因治疗（SCGT）就显得尤为重要。该方法就是将患者自体造血干细胞取出进行基因修正（如逆转录病毒载体介导的 DNA 转染）后，再导回体内去重建功能健全的免疫系统。因此在治疗后患者的不同免疫细胞系中定位基因转导细胞，并得知其含量，对于基因治疗的疗效评估至关重要。
 
实验方案：
实际细胞样本中导入外源片段数目未知且不定，从定量外源核酸含量出发难以准确获知目的细胞类型含量。所以要尝试使用 ddPCR 技术捕获单个细胞，微滴中裂解，再进行荧光 PCR 分别检测外源片段和内源基因，由两者的阳性微滴数之比即可简单计算出目的细胞含量。此方案称为单细胞 ddPCR（sc-ddPCR）系统（见下图）。

面临问题：
较之传统 ddPCR 要解决的新问题主要为：上样细胞数量控制为多少可得到捕获单细胞的目的；单细胞在微滴中如何裂解并成功发生 PCR 反应。
 
材料与方法：
选择可用于方案验证的实验材料很关键。这里用的是 K562 细胞系，另外将 K562 细胞经可表达 ADA（用于基因治疗）及 EGFP（可发荧光）的逆转录病毒载体进行基因转导，并确认为外源片段单拷贝整合的细胞称为 K562-AE 细胞，两者共同用于验证。后续用到的实验样本有外周血单核细胞（PBMCs）、脐带血单核细胞，以及来自基因治疗病人的外周血和骨髓样本。ddPCR 体系中 assay 设计检测的是外源载体序列（FAM 标记）和内源基因 RPP30（HEX 标记）。

针对第一个要解决的问题，体系中尝试不同 K562-AE 细胞上样量，根据 EGFP 所发荧光，在显微镜下观察细胞包裹情况，结果发现最佳上样量为 2000 细胞（vs. 8000 细胞），此时绝大多数包含细胞的微滴中仅含单一细胞（见下图）。 

针对第二个要解决的问题，采用在反应体系中加入终浓度 0.015% SDS 及额外的酶反应液，微滴生成后先经过 60 分钟的 85℃ 细胞裂解，再经过正常 ddPCR 反应条件（见下图），最终得到理想结果。

实验结果：
特异性验证——通过采用不同类型细胞测试所设计引物探针的反应情况和特异性，结果良好（见下图）。

准确性评估——将原始 K562 细胞和 K562-AE 细胞按不同比例梯度混合上样，由于已知 K562-AE 细胞内外源片段单拷贝，所以由传统 ddPCR 法提取核酸再检测目的片段含量可计算出 K562-AE 细胞含量（vector index），与 sc-ddPCR 结果作比较，结果均呈良好线性且一致性高，检测下限均可达 0.4% K562-AE 含量（见下图）。

实际病人样本测试——两位患有重症联合免疫缺陷的病人早期经过 GCsapM-ADA 逆转录病毒载体介导的干细胞基因治疗，现取得其外周血单核细胞和骨髓样本，通过流式分选出不同类型细胞，经 sc-ddPCR 检测，成功在不同类型细胞中测得含转导基因的细胞含量，且差别较大（下图左）。更妙的是，用传统 ddPCR 计算的细胞内平均外源基因拷贝数除以 sc-ddPCR 得到的目的细胞含量，还可计算出各种细胞中实际整合的外源基因拷贝数（下图右）。 

实验结论：
sc-ddPCR 实验方案被证明非常成功，无需提取核酸和预扩增，可以方便实用地对干细胞基因治疗进行有效的临床评估。该方案构思独特，立意新颖，证明了 ddPCR 技术有捕获单细胞并以细胞为单位进行定量检测的能力，再次刷新和拓展了 ddPCR 技术的应用潜能。
 
结语：
各位科研小伙伴们，在我们惊异于科学家的脑洞时，也请不要犹豫，快来发挥各自的想象力，一起来发掘 ddPCR 技术究竟能为我们的研究带来什么样的惊喜吧！
 
参考资料：
[1] Digital Quantification of Proteins and mRNA in Single Mammalian Cells. Cem A. et al. Molecular Cell, 2016.
[2] High-sensitivity assay for Hg (II) and Ag (I) ion detection: A new class of droplet digital PCR logic gates for an intelligent DNA calculator. Cheng N. et al.  Biosensors and Bioelectronics, 2016.
[3] Single Cell-Based Vector Tracing in Patients with ADA-SCID Treated with Stem Cell Gene Therapy. Yuka I. et al. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, 2017.

Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。