使用WB实验获得蛋白表达水平的可靠信息，必须使用适当的内参作为上样对照，这是高质量论文的基本要求。最重要的内参选择标准之一就是内参蛋白不应受到疾病病理生理学、性别或药物治疗等变量的影响。然而，大量精神疾病相关中枢神经系统的 mRNA 表达差异已经证实了 β-actin 与 GAPDH 广泛存在的表达不恒定。在 WB 实验中，内参蛋白还必须与组织中总蛋白保持恒定的比例。
越来越多的研究发现只有很少的蛋白种类在中枢神经系统中显示出内参蛋白应具有的特征。为证实这个问题，澳大利亚的神经学研究小组系统性检测了 194 名患有或未患有精神疾病的受试者在布罗德曼区 9 (Brodmann’s area 9，BA9) 9 中常用内参蛋白 β-actin 的水平（文献1）。
选择 BA 9 进行这项研究是因为它是背外侧前额叶皮层内的一个区域，该区域被认为受精神分裂症 和情绪障等疾病的病理生理学影响。对于这类样品的测似，有助于了解常用管家蛋白是否会随病理生理学而发生变化。
实验测试了 194 名受试者（包括 136 名男性和 58 名女性）的 BA 9 匀浆中 β-acin 的水平。这些受试者的平均年龄为 49 岁，平均脑重量为 1377 克，平均死后间隔时间（PMI）为 42 小时，平均中枢神经系统 pH 值为 6.32。其中包含 70 名没有精神或神经障碍病史的受试者、75 名精神分裂症受试者、24 名重度抑郁症受试者、17 名双相情感障碍受试者和 8 名没有可识别精神病的自杀者。
跨病例样本的 β-actin 信号总强度范围为 212 至 4461，变异系数为 47%。β-actin 的总强度在性别、自杀者或其他诊断方面没有显着差异。β-actin 的信号强度与年龄、中枢神经 pH、PMI、中枢神经重量、病期（DI）没有显著相关性。
研究还发现 β-actin 在人中枢神经系统中与组织总蛋白比例也不恒定，这与使用人源细胞系 MDA-MB-231 作为样品的 Western 数据相似：β-actin 水平并未反映起始总蛋白浓度（文献2）。此外，小鼠中的数据显示 β-acin 水平因组织而异（文献3）。这些数据都表明，β-actin 和其他看家蛋白（如 GAPDH）可能不应用作内参蛋白，除非它们在待研究的组织或细胞中显示出具有应有的特征（表达量恒定、不受疾病病理生理学或治疗影响、与总蛋白成恒定比例关系）。
与常用的管家蛋白相比，Stain-Free 免染总蛋白在不同神经组织部位（突触小泡、粗突触体、含有突触小泡的 LP1 上清液、突触体膜、可溶性突触体膜、突触后密度）的表达更为恒定，更适合作为神经相关样品 WB 的内参（文献4）。研究比较了 7 个月（对照）和 22 个月（老年）小鼠组织，细胞骨架蛋白的分析表明，老年小鼠的 actin 和 tubulin 水平发生了变化，生理衰老深刻影响与神经递质释放和囊泡循环相关的分子的丰度，这些分子与认知功能有关。与 Actin、tubulin 相比，Stain-Free 的表达在对照与老年小鼠间的表达一致性更高。
S1：突触小泡；P2：粗突触体；LS1：含有突触小泡的LP1上清液；LP1：突触体膜；SSM：可溶性突触体膜；PSD：突触后密度
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参考文献：Β-actin does not show the characteristics of a reference protein in human cortex. Electrophoresis, 2020
β‐Actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis, 2006
Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS one, 2013
Quantitative Immunoblotting Analyses Reveal that the Abundance of Actin, Tubulin, Synaptophysin and EEA1 Proteins is Altered in the Brains of Aged Mice. Neuroscience, 2020
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