QIAcuity数字PCR携手LNA技术，实现基因突变精准检测
发布时间：
2021-02-04 10:40
来源：凯杰企业管理（上海）有限公司
据不完全统计，目前约有10000多种人类疾病是由基因突变引起的[1]，其中癌症是对人类威胁最为严重的疾病之一。据世界卫生组织国际癌症研究机构 (IARC) 发布的2020年全球癌症数据显示，过去一年全球癌症新发1929万例，其中中国占23.7%；全球癌症死亡的30.1%也发生在中国。预防癌症发生的最有效的办法就是早发现、早预防、早治疗。而基因突变作为引发癌症发生的最重要因素之一，究其原因主要是基因突变诱导原癌基因的激活和抑癌基因的失活，从而导致细胞的过度增殖和免于细胞的凋亡[2]。稀有突变检测是指在野生型背景池中仅检测到1%甚至更低的突变体。所以，对于单碱基等稀有突变或单核苷酸多态性的检测和量化，数字PCR凭借特有的样品微反应单元分区技术，可以增加样品的有效反应浓度，减少背景信号干扰，降低PCR抑制剂对PCR扩增效率的影响，从而实现特定核酸序列的更精准和更灵敏的检测[3]。QIAGEN 2020年下半年重磅推出的QIAcuity一体化集成式纳米微孔板数字PCR系统将微反应单元制备、PCR扩增和数据读取集成到一台全自动仪器中，整个流程最快2小时内完成。QIAcuity采用专利纳米微孔板利用微流体技术对微反应单元做物理分割，使分配到每个纳米小孔中的反应液体积均一，无反应体系破裂融合或交叉污染，搭配特异性更高的QIAGEN LNA Mutation Assay，QIAcuity数字PCR系统为科学家们在稀有突变检测领域中的应用提供了一个更好的选择。QIAGEN在QIAcuity数字PCR平台上开发并验证了针对常见突变位点检测的250组dPCR LNA Mutation Assay，该Assay的引物和探针都经过锁核酸修饰来提高特异性及检测灵敏度。探针可选择FAM/HEX或Atto550/ROX双标记不仅可实现野生型和突变型靶标分子的同时检测更可在一管反应中进行多个靶标的检测。所有突变位点均选自COSMIC数据库，确保了突变位点研究的可靠性。所谓锁核酸 (Locked Nucleic Acid，LNA) 技术，是将寡核苷酸序列中的β-D-呋喃核糖的2’-O，4’-C位通过缩水形成的刚性结构，增加引物和探针的Tm值，从而实现更短的引物和探针设计。在检测稀有突变时，由于样本浓度低并且在突变前后整个靶标分子的序列可能仅有单个碱基的差别，通过锁核酸修饰的探针和引物增强了对互补序列的亲和力和特异性。经过锁核酸修饰的LNA Mutation Assay结合QIAcuity数字PCR平台可以在野生型基因组背景下检测到低于0.1%的突变体，对于液体活检中的ctDNA和cfDNA的低频突变检测尤为适合。QIAcuity数字PCR系统结合dPCR LNA Mutation Assay对不同梯度稀释的肿瘤样本进行检测。数据显示：检测值与预期值一致性良好，突变频率的检测限达到了0.1%。QIAcuity数字PCR系统结合dPCR LNA Mutation Assay对已知突变频率为0.1%的BRAF V600E基因进行检测。数据显示：检测值为0.13%，相当于每个已知突变样本中检测到6拷贝的突变分子，与预期值0.1%几乎一致。实验结果表明：数字PCR为检测野生型背景下的突变DNA序列提供了高精准度的检测方法；使用LNA增强的dPCR LNA Mutation的引物和探针，提高了检测的特异性和精准度。使用dPCR LNA Mutation Assay对含BRAF V600E突变样本检测结果的二维散点图
参考文献：
[1] Dissected OMIM Morbid Map Scorecard (Updated June 26th,2020)[2] Pothur R Srinivas,Barnett S Kramer,Sudhir Srivastava. Trends in biomarker research for cancer detection[J]. Lancet Oncology,2001,2(11).[3] Basu, A. S. (2017). Digital assays part I: partitioning statistics and digital PCR. SLASTECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation, 22(4), 369–386
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