睡美人转座子系统简介——无需病毒包装高效基因整合

Sleeping Beauty转座子系统由Sleeping Beauty（SB）转座酶和转座子组成，SB转座子系统可将特定的DNA序列插入脊椎动物的基因组中。 DNA转座子以剪切/粘贴的方式，将一条DNA片段转移到另一条DNA片段上。转座（Transposition）是一个精确的过程，在供体DNA分子中剪切特定的DNA片段，然后移至相同或不同DNA分子或基因组中的另一个位点。

Sleeping Beauty转座子系统原理示意图

睡美人转座酶因其在鱼类中发现的有缺陷的转座酶而被命名为睡美人。已经在许多不同鱼类的基因组中以各种非功能性形式发现了该转座酶，据信这种转座酶已经有数百万年的历史了。研究者通过融合和修饰各种已灭绝的转座酶来合成第一个功能性SB系统。此后，通过增加大量已灭绝的转座子序列之间的共有序列，然后测试各种变化的组合，进行了改进。

SB100X质粒图谱

1997年开发的Sleeping Beauty转座子系统（SB10）的基本功能版本不断更改，以提高转座子系统在细胞中的基因插入效率。 2009年，Zsuzsanna Izsvak的实验室筛选了许多SB转座酶变体，以检测哺乳动物细胞中的活跃程度。他们的努力产生了一种新的改良型SB转座酶SB100X，其效率比第一代转座酶高100倍（通过在HeLa细胞中进行的抗生素抗性基因的转座试验确定）。在他们的Nature Genetics论文中，实验室表明使用SB100x进行基因整合的效率与病毒载体的稳定转导效率相当。

SB蛋白的结构域组成和SB100X转座酶催化结构域（PDB 5CR4）35的晶体结构，其hsSB取代标记为（红色）。 结构上被掩埋的半胱氨酸（灰色）被突变为对照。

2019年Querques等研究者将突变I212S和C176S引入SB100X转座酶。 改善了SB转座酶的蛋白稳定性，溶解度和聚集特性。通过引入这两个突变，创建了一种新型的转座酶变体，称为高溶解性SB（hsSB），显著提高溶解性和稳定性。hsSB能够被纯化，具有生物活性的重组蛋白，也可以将蛋白电穿孔到细胞中，进行冻融循环，而不会影响转座酶的活性和抗热激性。已证明，hsSB蛋白的电转能够介导各种人类和哺乳动物细胞类型的基因整合（包括难以转染的细胞模型，例如胚胎干细胞，HSPC，诱导多能干细胞（iPSC），T细胞和原代细胞），使用hsSB修饰以表达抗CD19 CAR，在已批准的基于病毒载体的市售产品中，该CD19 CAR在异种移植小鼠中显示出生物学活性和抗肿瘤能力。

利用SB转座子技术一步产生转基因牛

与经典的直接原核注射或慢病毒介导的转基因方法相比，SB介导的转基因不易发生基因镶嵌和基因沉默。转座子载体与特定的启动子元件结合，可以在组织中控制基因表达的程度，特异性的控制转基因表达。目前，研究者已经建立了不同种属中使用SB实现高效转基因的实验流程，包括斑马鱼，小鼠和大鼠中的持续转基因表达，兔子，猪和牛。值得注意的是，即使在牛这种的大型动物模型中，利用SB产生多转基因动物的方法也获得了成功。已建立的方案能够在相对短的时间范围内产生复杂的转基因基因型。

SB转座子系统，作为一种非病毒载体转基因技术，它能够在短时间内产生足量转基因细胞用于临床治疗，同时具有相对较低的成本，质粒在储存期间的稳定性大于病毒载体，同时也非常安全。

插图显示了基于SB转座子系统的CAR-T细胞的血液恶性肿瘤的免疫治疗方案

SB转座子系统作为基因呈递系统的临床应用，作为二线治疗方案，在CD19+急性白血病和淋巴瘤晚期患者中得到了最广泛的检验。SB系统用于用第二代CAR靶向CD19的基因工程T细胞，从而将T细胞重新导向CD19表达的肿瘤。大多数临床试验都使用慢病毒转染修饰T细胞，使其表达第二代CARs，包括单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD28或4-1BB(CD137)共刺激域融合片段，与嵌合体CD3-ξ提供'信号1和2' (即由CD3-ξ和CD28发起的信号)。给予患者来源的第二代CD19+CAR-T细胞在化疗难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中表现出活性，反应率高达90%，在难治性B细胞淋巴瘤患者中总反应率高达70%。

MD安德森癌症中心(MDACC)的一个小组利用SB非病毒系统将CAR导入患者和供体衍生的T细胞中。80名患者已经被招募到这些临床试验中，表明转座子工程CAR-T产品的生产具有可行性和稳健性。通过电转方法制备的CAR-T细胞效率与慢病毒载体相似，但是成本远低于慢病毒方法。

SB转座子的质粒体系通常有以上三种方式，SB转座酶可以是1. 单独质粒骨架，2.目的基因在同一个质粒骨架，3. 或体外合成的mRNA。由于SB转座酶需要的拷贝数通常高于目的基因，因此1和3形式的反应体系较为多见。一个目的基因的拷贝大约需要4个SB转座酶蛋白分子，这样的比例可以产生最高的基因整合效率。

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