在上一期，我们一起了解过在流式样本制备中，如何获得小鼠脾脏样本。
骨髓是造血的场所，可分离出红细胞、粒细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞和造血干细胞等血源性细胞[1]。此外，骨髓也可以作为充质干细胞的来源[2]。分离后的骨髓细胞应用非常广泛，例如直接用于骨髓移植，流式细胞术分析造血干细胞亚群以及各淋巴细胞亚群，或者进行巨噬细胞极化、树突状细胞分化等。那么接下来我们和Dr 赛一起看看怎么得到小鼠骨髓细胞吧！
实验材料
细胞培养皿
75% 酒精
RPMI 1640完全培养基（胎牛血清：终浓度 10%；L-Glutamine：终浓度2 mM；可选：1% v/v青霉素-链霉素。）
灭菌的眼科剪和镊子（或刀片）
1-3 mL 注射器（无菌）
25 号针头（无菌）
无菌70 μm 细胞筛网
无菌50 mL 离心管
红细胞（RBC）裂解缓冲液：如果非无菌，建议通过0.22um滤膜除菌
Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪
磷酸盐缓冲液（PBS）
实验步骤
Part Ⅰ 获取股骨
1. 处死小鼠后，用75%酒精充分消毒，在无菌条件下分离小鼠股骨，股骨是位于膝关节与骨盆胯关节之间的长骨 （请参考图一）。
2. 在剥离时，请在骨盆跨关节上方剪下大腿，并在在膝关节下方可活动处剪下股骨下端。注意剥离过程中不要破坏股骨两端关节（请参考图二至图三）。
3. 使用无菌的剪刀，镊子剪掉骨头上的肌肉和纤维组织，整个操作过程留意不要破坏关节或者骨头。可用剪刀刮除骨头表面的肌肉获得如图四所示的股骨。
4. 为获得更多骨髓细胞，可用上述相似的方法获取胫骨内骨髓细胞。
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Part II 收集骨髓细胞
5. 可将完整的骨头置于培养皿中，使用75%酒精清洗1-2min，再放入含有无菌PBS的培养皿中洗掉酒精。
6. 将 70 µm 细胞筛网置于 50 mL 离心管顶部。
7. 用无菌的眼科剪剪断股骨的两端关节，暴露出骨髓腔（请参考图五），将 25 号针头装在注射器上。用注射器抽吸5 mL左右完全培养基。
8. 用镊子将骨头直立于筛网上方，再用注射器小心将骨髓冲出来（请参考图六）。必要时，重复冲洗，当骨头呈白色则表明已冲出所有骨髓（请参考图七）。对所有骨头重复该步骤。
9. 如果剪掉的股骨关节较大，可进一步用剪刀将其剪碎，并用1mL移液器冲洗。
10. 使用注射器的柱塞（请勿触摸柱塞的黑色橡胶；保持无菌），向下用力顺/逆时针捣碎细胞筛网中的骨髓（请参考图八）。确认骨髓均被捣碎，没有块状。
11. 用 RPMI 完全培养基将柱塞端剩下的骨髓冲到筛网中，尽可能多地收集骨髓。
12. 用完全培养基冲洗筛网。取下筛网，盖上盖子。在 4°C 下 600 x g 离心细胞 4 分钟。丢弃上清液（请参考图九）。
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13. 加入 5 mL 左右的完全培养基重悬细胞，上下吹打。可重新过筛，获取单细胞悬液。
Dr.赛友情提示：这一步红细胞还未裂解，如果需要计数建议使用AO/PI 荧光法计数有核细胞哦。推荐大家使用赛默飞的ReadyCount™ Green/Red Viability Stain （cat# A49905）搭配Countess 3FL，此试剂中AO和PI两种荧光染料的比例经过优化，可以快捷准确地反映死活细胞的数量。
14. 用适当的培养基将细胞重悬，使达到所需的细胞浓度。
15. 根据下游的应用决定是否需要裂解红细胞或者直接进行培养、分析等（红细胞裂解后也可以利用台盼蓝或AO/PI染色后进行计数哦）。
Question & Answer
问
为什么我分离得到的骨髓细胞很少呢？
答
在剥离骨头和肌肉时，股骨的两端关节一定要完整保留，若是剪破，可能会导致细胞损失；其次，剪下的关节可进一步剪碎，股骨一定要充分冲洗直至苍白；最后收集的骨髓在过筛时可以再进行研磨。当然，如果需要尽量多的骨髓细胞，也可以再分离胫骨和肱骨内的骨髓细胞，其步骤与上述相似哦。此外，也要使用健康的小鼠进行实验。
问
为什么我获取的骨髓细胞会出现微生物污染呢？
答
小鼠处死后，请充分为小鼠皮毛和身体灭菌。获得完整的股骨后，也可以使其浸泡与酒精中进一步消毒，实验用到的眼科剪和镊子均需要灭菌。若还是不放心，可以在培养基中添加一定的抗生素。
问
我获得的骨髓细胞是否必须裂解红细胞呢？
答
这个问题需要根据自己的下游实验来参考文献；例如如果需要培养获取MSC, 可以不裂解直接培养；如果需要利用骨髓中单核细胞分化成为巨噬或者树突状细胞，一般需要裂红（可以使用货号为00-4333-57的理解液，注意使用前需要过滤除菌）。有一些特殊情况，如骨髓粒细胞分离，为了不激活粒细胞，则需要用特殊的裂解方式结合密度梯度离心的方法，可以看看文献【3】哦。
问
我该用多大周龄的小鼠分离骨髓细胞呢？获取的细胞数量在什么数量级是正常的呢？
答
一般使用成年小鼠进行实验，至少需要大于6周。如果有特殊的疾病模型，则需要进一步参考文献并结合实验摸索。文献报道，对于C57BL/6 这个品系的小鼠，收集两根股骨并裂解红细胞后，约有107-108个骨髓细胞。当然，不同周龄、品系和模型在数量上还会有差异的。
参考文献：
[1] Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow
[2] An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow
[3] Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments
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