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史碧云
食品组学✦
飞飞在周二带大家领略了GC-Orbitrap的魅力，想来朋友圈还在飘着羊肉串味，今天呈上食品研究的第二弹，给周末的餐加点料~
随着组学技术的发展，食品组学的概念应运而生，食品组学使用组学的方法对食品和营养物质等领域进行研究，旨在帮助提高消费者的健康和福祉，并对食品中的小分子化合物与人类健康之间的关系提供生物学解释。
西班牙阿尔梅里亚大学(University of Almeria)的Romero-González教授使用食品组学的手段，采用UHPLC-Q Exactive MS对三个不同产地(斯里兰卡、越南和巴西)及两种采摘后加工方式(灭菌和非灭菌)的黑胡椒样品进行了分析，采用主成分分析(PCA)的方法对所有样品进行整体的聚类，并使用正交-偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)进行有效的区分，找到同产地和加工方式相关的8个差异代谢物，为黑胡椒的产地和真伪鉴别提供了有力的支持。
实验设计如下图所示，研究者收集了20份黑胡椒的样品，其中10个样品产自巴西，6个为斯里兰卡，4个产自越南；这些样品中，分别有一半样品经蒸汽灭菌处理(HT)，另一半未处理(non-HT)。
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样品处理过程如下：
01
取50.0 ± 0.1 mg样品于15 mL离心管中，加入5 mL 50%乙腈溶液，室温下超声30 min进行化合物提取；
02
将离心管于5,000 rpm离心并过0.22 um尼龙滤膜；
03
每个样品取1 mL，3份重复，并将所有60份样品分别取50 uL混合得到QC样品，以50%乙腈溶液为空白样品，进行UHPLC-Q Exactive MS数据采集。
在数据采集的过程中，对黑胡椒提取物样品进行随机顺序采集，并且每隔10针进样插入一针QC样品，从而达到数据质量控制的目的。
数据的采集在Vanquish+Q Exactive液质联用平台上进行，使用FullMS-ddMS2(TopN)的方式，一次进样即可同时采集该样品的一级和二级高分辨率和高质量精度的数据，既可在一级数据水平完美分辨复杂的基质，又可获得高精度的二级数据进行谱图库的准确匹配得到待测物的结构信息。随机选择一个数据的总离子流图如下所示(A:正离子模式, B:负离子模式)。
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数据采集完成后，将其导入Compound Discoverer™ 软件进行处理，Compound Discoverer软件包含对小分子化合物进行鉴定、表征的完整方案，用户可将原始数据导入软件，使用简明完整的工作流程进行数据的提峰、未知化合物鉴定、数据库自动搜索匹配、测定样品之间的差异以及阐明生物学通路等工作，软件还提供mzLogic、谱图距离计算及分子网络等算法对鉴定及通路的结果进行补充和拓展。Compound Discoverer的完整工作流程如下图所示，用户可根据实际需要修改数据库和代谢通路库的选择、设置峰面积归一化及差异分析的方法等。
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在对数据进行组学分析时，首先采用主成分分析(PCA)的方法对所有样品进行整体聚类，下左图为PCA散点图，每个点代表一个样品，由图可见， QC样品聚集在散点图中心位置，提示数据质量优秀，化学计量分析适用性高；斯里兰卡的样品和其它两个产地的样品沿PC1轴明显分开，而越南和巴西的样品较聚集，提示斯里兰卡的黑胡椒同其它两个产地差别较大；每组样品的蒸汽灭菌同未灭菌的点距离较近，提示黑胡椒的采摘后加工方式引起的差异小于产地的差异。与此同时，对数据做的HCA聚类分析也可得出相似结论(下右图)，值得注意的是巴西的样品(组3、4和5)中有两个同越南的样品(组7)被聚至同一子集，这提示大面积区域(如巴西)的气候差异对黑胡椒代谢组成有较大影响。
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在统计分析的第二个部分，为找到不同产地及不同采摘后加工方式的黑胡椒样品的差异化合物，使用有监督的正交-偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)进行区分(结果见下图)，并针对峰表进行ANOVA分析，设置p<0.05和VIP>1.5为阈值，对结果进行过滤，得到在不同产地及加工方式的黑胡椒样品差别较大的8个特征峰，作为差异化合物。
A: 不同产地, B: 不同处理方式
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在化合物指认的过程中，研究者以mzCloud谱图库为主要参考，mzCloud是使用Orbitrap采集的标准品谱图库，该谱图库为在线的公开谱图库(https://www.mzcloud.org/)，现包含超过19,000个化合物，并且这个数量还在不断增加，实测谱图的数量超过870万张，包含不同碎裂方式及碰撞能的信息，以及碎片结构式和碎裂曲线，为支持化合物准确指认的利器。通过Compound Discoverer软件，用户可连接mzCloud谱图库，并对数据进行自动化批量搜索及相似度匹配，其结果在软件界面以镜像图的形式呈现，并将匹配碎片的结构标注在图中，详见下图示例。
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使用mzCloud谱图库和ChemSpider数据库对8个差异化合物进行鉴定，结果详见下表，差异化合物包括脂肪酸、固醇衍生物、萜烯内酯等。
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同产地相关的3个差异化合物的箱式图及热图如下所示，由图可看出，3个化合物在各产地的含量趋势是一致的，在斯里兰卡和越南的样品中含量的聚集程度较高，而产地为巴西的黑胡椒样品中含量的离散程度较高，这与聚类分析的结果类似，可能与产地面积及气候多样性有关，差异代谢物较多为内酯类物质。
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同加工方式相关的5个差异化合物的箱式图及热图如下所示，由图可看出，5个化合物在不同加工方式的样品中变化趋势基本一致，然而其离散程度基本都较高，差异化合物较多为脂肪酸类，在未进行蒸汽灭菌的样品中含量较高，可能由于加热过程对脂肪酸有一定影响。热图的结果也可直观地看出，差异化合物在不同加工方式后的含量趋势并不明显，提示产地比采摘后加工方式对黑胡椒的品质影响更大，这个结论同非监督的聚类分析的结果类似，也验证了OPLS-DA模型的适用性以及差异代谢物的准确性。
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到此，使用UHPLC-Orbitrap HRMS对不同产地和采摘后处理方式的黑胡椒样品的食品组学分析的完整流程展示完毕，工作了一周的各位看官想必已经看饿了，周五的食谱是不是已经选好了呢，那就黑胡椒料理走起吧~
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