TSCP 引领单细胞蛋白组学进入Turbo 时代

日益成熟的蛋白组学技术发展到今天，研究人员不断提出新的需求，其中单细胞蛋白组分析称得上是其中的大热门。应用单细胞技术，我们可以研究极低样品量的样品，可以对比异质性的细胞或者组织，可以寻找细胞分化、胚胎发育过程中的变化。但同样我们也意识到，其最大的研究难点都集中在这个“单”字，意味着我们的研究对象含量极低，不能使用常规的方法进行处理，分析的手段也必须具备更高灵敏度；同样的，单个细胞的分析会很大程度增加需要分析的样品数目，通量的重要性也必须考虑。

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来自丹麦的科研人员在bioRxiv 预印本上发表了最新的基于 Astral 的单细胞蛋白组分析的文章，可以 40 SPD 的通量在单个 Hela 细胞中获取超过 5000 个蛋白鉴定^[1]。因此，我们首先进行了一系列的验证工作，确定该方案的性能表现，接着尝试着做了一些改变，完善整体解决方案。

40SPD，单个 Hela 细胞超过5000 个蛋白鉴定^[1]

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第一步我们需要获取单细胞，而其获取方式也有好几种，例如流式细胞仪分选，微流控技术、cellenONE、激光辅助显微切割等。这次我们选用了 cellenONE 体系进行单细胞分离，但如果各位使用其它的方案分离单细胞，或者使用一些比较大的单细胞，例如卵细胞等，可以从第二部分 “单细胞蛋白组样品前处理” 开始阅读，同样适用。

我们选择了 Hela 细胞作为分析对象，分别分离了单个细胞，10个细胞和20个细胞进行后续的分析。

Hela 单细胞分离

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由于单个细胞蛋白含量极低，其中单个 Hela 细胞约含 150-600 pg 总蛋白，因此在进行样品前处理时，需要控制反应体系，保证其酶解效率。我们在流程验证中使用了与文献1一致的 proteoCHIP，并在后续尝试使用不同的孔板，96 或 384 孔板的形式，尽可能控制反应体系的大小。

样品前处理过程^[2]如下所示，步骤依次为加入酶解液，分选细胞，孵育，以及根据所使用的 proteoCHIP 或者孔板，将样品转移至 evotip 后上样或者直接上样。

单细胞蛋白组样品前处理过程

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但如果各位使用其它的方案进行样品前处理，例如使用一些比较大的单细胞，卵细胞时使用 PCR管控制反应体系进行处理，可以从第三部分 “LC-MS 分析” 开始阅读，同样适用。

不同于常规上样量的分析方法，单细胞蛋白组中通常需要优化色谱与质谱条件使其更符合低上样量的样品，包括但不限于更低的液相流速、使用 FAIMS Pro，延长二级离子注入时间等条件。通常，可以使用稀释的肽段样品，模拟单细胞样品上样量获取优化的分析条件，也可将该样品作为整个流程的质控样品，检测系统状态。

如图所示，FAIMS Pro 接口可有效去除背景噪音，从谱图中可观察到更多的肽段信号，可提高整体的鉴定深度，更有利于少量样品的分析。因此在后续分析中均使用了 FAIMS Pro 接口。

单细胞样品的 BPC 图对比，不加和加载 FAIMS Pro

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我们使用稀释的 Hela 肽段进行色谱与质谱方法的优化，结果下图所示。250 pg Hela 肽段可获得近 6000 蛋白鉴定，近45000 肽段，与文献报道一致^[3]，确证系统状态正常。

Hela 肽段不同稀释上样量的蛋白和肽段鉴定结果，数据分析使用 directDIA，不同上样量的样品之间不做合并分析（点击查看大图）

流程验证结果：40SPD 时，单个 Hela 细胞可获得 5000+ 蛋白鉴定（点击查看大图）

首先，我们进行了流程验证，将处理后的单细胞，10个细胞和 20 个细胞样品分别上样，结果如上图所示。使用与文献1一致的流程，通量 40 SPD 时，Orbitrap Astral在单个 Hela 细胞中可获得 5000+ 蛋白鉴定，与文献报道结果一致，确证了该单细胞蛋白组分析方案的可行性及仪器性能的稳定性。

接着，我们在此基础上，进行了一些改变，使用兼容性孔板进行单细胞分离，进行样品前处理后可直接放置在 Vanquish Neo 液相系统中上样，使用 60 SPD 的方法，结果可在单个细胞中获得6500+ 蛋白鉴定。

Vanquish Neo + Astral，60SPD 时，单个 Hela 细胞可获得 6500+ 蛋白鉴定（点击查看大图）

需要我们注意的是，即使是同样的 Hela 细胞，不同实验室、不同传代次数、不同直径大小、等等因素都会影响到最终的单细胞蛋白组分析结果。

另外，如果考虑进一步通量的提高，也可以尝试使用 TMT 等多重通道标记试剂的方法。