SNP 位点测定新方法——毛细管电泳技术

SNP（single nucleotide polymorphism），即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个 SNP  位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。

SNP 绝大多数位于非编码区，多为转换，即一种嘧啶碱基换为另一种嘧啶碱基，或一种嘌呤碱基换为另一种嘌呤碱基，转换与颠换之比为 2：1。目前，研究 SNP 突变变得越来越热门，因为 SNP 位点数量丰富，可以找到与各种遗传性状相关的突变，而且有些SNP与某些性状调控基因相邻，可以成为重要的分子标记。

SNP 检测方法有TaqMan 探针法（进行实时荧光 PCR 扩增），高分辨率熔解曲线分析法（HRM），Mass Array 法（质谱检测）和直接测序检测等，但是以上方法均需要昂贵的技术设备做支撑，而且操作技术水平要求较高。目前，如果想将一个 SNP 的分子标记推广开来，且要实现快速分析，可以通过特殊的引物设计方法扩增 PCR 产物，直接利用普通传统电泳法或者毛细管电泳技术完成快速检测。

以中国药科大学药物分析教研室和南京军区联勤部药品仪器检验所开发的一个 SNP  分子标记，用于区别人参（Panax ginseng C.A.Mey）和西洋参（Panax quinqufoliw L.）的一个科研成果为例。首先，通过查找GenBank，寻找 SNP 位点，发现人参、西洋参在 5.8s 基因的 235 bp 处，人参为 A，西洋参为 G； 414 bp 处，西洋参为 T，人参为 C。其次，选择这 2 个 SNP 位点进行特异性引物设计和 PCR 扩增，3’端的最后一个碱基与 SNP 位点互补。为了提高扩增特异性，在引物 3’端的第 3 个碱基处人为引入 1 个错配碱基，最终设计出来的三条引物中，有一条是公共引物 Pl: 5' -cgaaacctgcatagcagaac- 3’，再是人参特异性引物 ASA-3:  5’-agagccgagatatccgttgT-3’，及西洋参特异性引物 ASA-4:  5’-cgcctcgactcccgcaaA-3’。最终 PCR 产物电泳结果显示，扩增产物大小为 252bp 的为人参，430bp 的为西洋参，简单明了（图 1）。另外，基于毛细管电泳的高灵敏度特性，当人参中掺有 5% 比例的西洋参核酸 DNA 时，也可检测到西洋参的扩增讯号（图 2），此特性可以用于出入境的食品药品真假及纯度鉴定。


 
图1 毛细管电泳分析 PCR 产物

 
图2  利用毛细管电泳的高灵敏特性分析不同掺杂比例样本